综述：面向端到端连续生物制药生产：当前进展与展望

《New Biotechnology》：Toward End-to-End Continuous Biopharmaceutical Manufacturing: Current Advances and Prospects

　　

端到端连续生物制药生产将过程强化从改进的独立单元操作扩展至旨在实现长时间运行且最小化中间储池的集成工艺序列。本综述系统总结了上游与下游处理的最新进展，并将端到端连续性视为一种系统层面的集成与界面工程问题，在该框架下需要联合管理通量、停留时间行为与质量。上游灌流培养能够维持高活细胞密度与高生产率，但也收紧了对关键工艺参数的约束，并要求稳健的监测手段以提供稳定的进料。在下游处理中，连续捕获与精纯、连续调节以及兼容连续模式的病毒清除步骤正日益具备可行性。然而，长周期运行的稳健性、循环动力学以及对进料波动的敏感性仍是核心考量因素。通过对集成案例的分析发现，主要障碍并非缺乏连续单元操作，而是未解决的界面失配，尤其是稳态的上游收获与周期性下游操作之间的失配，除非通过停留时间与循环时间的同步、在线调节以及长周期过滤性能管理来消除这种失配，否则将不可避免地产生缓冲储液与暂存需求。此外，过程分析技术(PAT)与数字孪生(DT)为实时可观测性与控制提供了基础，而超缩小(USD)与高通量开发流程则加速了操作窗口的定义，并为模型校准与控制设计生成数据。总体而言，实用的端到端连续性依赖于界面工程、平台级集成以及针对长时间连续运行的可靠验证策略的协同推进。

1 引言

生物加工随着生物制药市场的快速增长已发生显著演变。现代生物制药生产工艺通常分为两个耦合的领域：上游处理(USP)，即通过生物合成（如基于细胞培养的生产）产生产品流；以及下游处理(DSP)，即对产品进行纯化与调节以满足质量与安全要求。过去二十年，细胞系工程、表达系统以及强化培养模式（尤其是灌流生物反应器）的实质性进展大幅提升了上游生产率。传统补料分批系统的滴度通常为1–5 g/L，而强化与延长培养可达到10–13 g/L。这些上游的提升将主要生产瓶颈转移至下游操作。在包括单克隆抗体(mAb)在内的生物治疗药物生产中，下游处理可占总生产成本的80%。随着上游滴度的持续上升，下游纯化的经济与运营压力不断加大，促使工艺架构发生根本性改变，而非仅对单个单元操作进行增量优化。因此，连续生物加工成为应对成本、效率与灵活性约束的战略选择。结合强化单元操作、一次性技术(SUT)与过程分析技术(PAT)的集成连续生物制造(ICB)平台，已在建模研究与中试规模演示中被报道可降低生产成本、提高生产率并缩短生产周期。监管支持也在同步推进，最显著的是国际协调理事会(ICH)于2023年发布并被监管机构采纳的关于连续生产的Q13指导原则。除工艺经济性外，劳动力短缺、GMP培训负担、供应链脆弱性以及对更自动化、灵活制造能力的需求，也在日益塑造连续生物制造的采用进程。尽管正式提出时间相对较晚，连续生物制造已从概念迅速走向实施。近期的工业部署表明，连续制造可在数据丰富和高度自动化的环境中运行，配备广泛的在线分析技术，能够在长时间生产周期内实现高频监测与控制。重要的是，实现端到端连续生物制药生产的挑战不仅限于单个连续单元操作的可用性，还涉及将它们集成为稳定的工艺序列。上游灌流可提供接近稳态的收获流，而关键的下游操作（尤其是多柱色谱）通常以周期性方式运行。若不对流速、停留时间分布(RTD)、操作条件进行刻意同步，则会引入中间缓冲或暂存步骤，从而削弱真正的端到端连续性并增加工艺复杂性。这些界面失配属于集成层面的约束，区别于单元操作特有的限制（如污染、设备可靠性、局部控制不稳定性）。因此，端到端连续生物制药生产应被视为一种系统层面的设计与界面工程问题，需要在互连单元间联合管理通量、停留时间行为、工艺稳健性与产品质量。以往综述多将连续单元操作、PAT或数字孪生(DT)作为独立领域讨论，本综述提出了面向端到端连续生物制药生产的产线级多层集成框架。在该框架中，实际连续性由四个耦合层的相互作用决定：(i) 定义局部工艺性能的强化单元操作；(ii) 调和单元间流速、RTD、物理化学与时间失配的界面工程；(iii) 基于PAT、自动化与DT的数字协调层，实现实时可观测性、控制与监督决策；(iv) 包括超缩小(USD)与高通量筛选(HTS)策略的开发流程，用于界定可行的操作与控制空间。这种分层视角将连续生物制造重新定义为系统层面的协调问题，而非单个连续单元操作的集合。本综述总结了关键连续单元操作的最新进展，包括以灌流为代表的强化上游策略、受周期性计数器色谱(PCC)与模拟移动床(SMB)启发的多柱色谱，以及包括单程超滤/渗滤(SPTFF)、连续UF/DF和病毒过滤适配在内的连续过滤与缓冲液置换操作。在此基础上，综述探讨了这些技术如何被集成到端到端连续生物制药生产平台中，重点关注界面设计、工艺集成与数字方法作为实际连续性的核心要素。后续章节将讨论上下游工艺的创新、工艺序列集成与界面工程、PAT、自动化与DT在协调长周期运行中的作用，以及通过基于RTD的可追溯性、PAT支持的监测、实时放行检测(RTRT)、基于质量源于设计(QbD)的控制策略和模型生命周期管理进行的监管实施。综述还将讨论USD、HTS和基于模型的开发流程，随后分析技术经济与可持续性考量，以及与劳动力、GMP培训、供应链脆弱性和灵活制造能力相关的更广泛采用约束。

2 连续生物制造的过程强化

连续制造已被报道可减少周期时间、设备占地面积和工艺成本，同时提高设备利用率，尤其是在集成和减少储池的配置中。例如，集成连续mAb生产系统已证明可将总处理时间减少至少75%。此外，无储池或最小化储池的产线已被报道可减少总工艺时间20–30%。技术经济分析进一步表明，与分批设计相比，连续架构可降低所需设施体积与资本强度。由于定量故障率数据很少以标准化方式报道，故障相关性能主要通过扰动传播、污染、自动化依赖、偏差可检测性和残余缓冲/暂存需求进行定性比较。总体而言，比较表明连续生物制造并非仅靠用连续类似物替代分批单元操作就能优于分批制造。其优势来自于在工艺产线层面同时实现更高的设备利用率、减少的暂存体积、更短的停留时间、改善的树脂与缓冲液效率、减小的占地面积以及PAT支持的控制。相反，连续操作引入了新脆弱性，包括扰动传播、自动化依赖、测量延迟、RTD诱导的不确定性、污染累积、耗材负担以及对数据集成和控制回路验证的更高要求。因此，从分批到连续的转型应使用综合的技术经济、可持续性和运行性能指标进行评估，而非仅依赖孤立的单元操作生产率。在此背景下，成本和可持续性效益应被解释为依赖于生产周期、产品滴度、下游同步性、树脂和膜利用率、培养基和缓冲液需求、设施利用率以及缓冲或暂存体积的消除程度。连续制造的运行和经济收益主要由工艺生产率和资产利用率的提升驱动。与传统分批序列中包含步骤间闲置时间相比，连续操作提高了有效设备利用率。此外，减少中间储池和暂存时间可以降低产品稳定性风险，例如与长时间暴露于工艺相关应力相关的聚集和降解，在适当工程设计下支持更一致的产品质量。虽然这些益处常被归因于采用连续操作，但更根本地是由过程强化所实现的——过程强化被定义为开发新型装置和技术，在适当的工艺设计和利用支持下，提供比传统加工更显著的改进，通常表现为更小、更清洁和更节能的制造。在生物制药生产中，强化通常以渐进方式实施，从单个单元操作开始，逐步推进到越来越集成的工艺配置。这种向连续制造的推进已通过四级框架形式化。0级对应传统分批操作。1级代表单元操作强化，在不进行操作时序耦合的情况下，增强单个上游或下游步骤以改善纯度、收率、通量或可达成浓度等性能指标。2级涉及连接多个强化单元操作，使其连续且同步运行。在下游处理中，这通常通过循环或周期性操作实现，例如多柱色谱，需要使用缓冲罐或中间罐来调节单元操作间的流速和时间失配。3级代表完全连接且自动化的连续制造产线，以接近稳态的方式运行。在此级别，连续上游来源（如灌流培养）直接与端到端连续下游纯化序列连接，具有最小的滞留体积。此类集成支持先进控制策略，并在适用情况下支持PAT支持的实时放行方法，相较于传统的终产品检测流程缩短了整体制造和处置时间线。多项研究对不同阶段和程度的连续制造实施进行了经济分析。结果表明，净现值(NPC)随着分批工艺日益强化和连接而降低。然而，也有更细致的观点指出，虽然完全集成的连续工艺显示出最低的生产成本(COGs)，约28.2美元/克，但完全端到端连续加工是否必要不能简单回答“是”或“否”。分析显示完全集成连续加工可降低生产成本约70%，但混合方法也可实现约60%的成本降低。因此，混合制造在经济上仍可保持竞争力，同时避免了完全端到端连续实施所带来的部分复杂性、集成负担和运行风险。人工智能和机器学习工具的集成有助于利用自动化进行预测控制，并帮助解决随连续制造增加而增加的运行复杂性。过程强化的目标是实现端到端连续制造平台，其中所有单元操作按顺序连接，无需中间暂存步骤。尽管连续加工在制药、食品和化工行业已很成熟，但生物制药生产仍主要以分批为基础，当前工业实践以1级和2级实施为主。因此，实现完全集成的3级操作仍然是该领域的核心挑战，需要对强化单元操作、其接口以及整个制造产线的集成和控制策略进行协调设计。以下小节将描述上下游操作中的强化模式，并审视制约可行端到端连续制造设计的集成约束。

2.1 连续上游处理

灌流培养是高生产率哺乳动物细胞培养的 dominant 连续上游模式，其中新鲜培养基持续供应，含产品上清被抽出，细胞通过分离装置保留在生物反应器中。这种架构支持持续的高活细胞密度(VCD)和体积生产率，通常报道约为补料分批的2–5倍，在代表性条件下可达80–120×10⁶cells mL^-1。通过将体积生产率与生物反应器工作体积解耦，灌流可以减小所需的生物反应器规模和设施占地面积，并提高与一次性技术(SUT)的兼容性。尽管早在20世纪80年代末就有演示，但广泛采用历史上受到细胞系生产力有限、血清依赖性培养基以及细胞截留硬件不够稳健的限制。过去三十年，细胞系和表达工程、基于代谢理解的血清游离培养基设计，以及切向流和交替切向流过滤(TFF/ATF)等细胞截留技术的成熟，使得灌流操作在制造规模上具有操作稳健性和经济可行性。然而，在长期灌流培养中，持续的生产力还取决于生产细胞系的遗传和表型稳定性，因为延长的生产性操作可能暴露出生产力损失、克隆漂移或质量不稳定性，而这些在传统补料分批过程中可能不太明显。在实践中，持续的灌流性能是通过四个耦合要素的协调设计建立的：(i) 设定可行细胞密度和剪切或压力暴露的细胞截留硬件；(ii) 控制生长、代谢、生产力和关键质量属性(CQA)的关键工艺参数(CPP)操作窗口；(iii) 管理营养供应、副产物控制和培养基成本的培养基和补料策略；(iv) 支持长期生产性操作的细胞系稳定性策略。以下小节总结了这些要素中的代表性技术和流程，并将其与长周期连续操作联系起来。

2.1.1 细胞分离装置

细胞截留装置是可实现VCD、收获澄清度和长周期稳健性的主要硬件决定因素，同时也施加了直接影响CPP选择的剪切和压力约束。螺旋惯性微流控分离器利用螺旋通道中曲率诱导的次级流产生的惯性升力和迪恩拽力平衡，实现细胞和培养液的尺寸分离。作为一种无膜选项，它们在实验室规模的灌流澄清中受到关注。在22天的CHO灌流中，3D打印螺旋保持了>97%的活率，截留率>99.9%。然而，将螺旋微流体转化为制造规模的灌流仍然具有挑战性，因为通量受限于通道尺寸和可接受的压力降。为解决这一约束，设计了堆叠塑料螺旋模块以避免聚二甲基硅氧烷变形，并实现了高达1 L min^-1的通量，表明高细胞密度操作存在潜在的放大路径。另一类无膜细胞截留装置是水力旋流器，已广泛用于灌流生物反应器应用。在这些单元中，切向入口产生高速旋转流，在圆柱-圆锥几何结构中形成径向压力梯度和离心场，将细胞分离为浓缩底流和澄清溢流。水力旋流器提供高体积通量并避免与膜相关的污染，但分离所需的高流速可能造成升高的剪切应力和压力波动，损害细胞活力。在制造相关规模，基于水力旋流器的截留已在长周期灌流中证明了操作稳定性。为提高总体回收率，开发了两级配置，其中水力旋流器执行大容量细胞分离，下游螺旋微通道进一步处理溢流进行抛光，在细胞密度约8×10⁷cells mL^-1时实现超过90%的总体细胞截留率。

2.1.2 工艺参数优化

给定选定的截留策略，CPP操作窗口必须在高细胞密度下维持活力和生产力，同时限制可能损害CQA并增加培养基消耗的代谢漂移。流体动力应力的主要来源取决于设备和操作模式。通气会增加细胞死亡，搅拌会改变细胞能量分配，进而影响重组蛋白合成。截留本身也可能是一种应激源。由于这些影响是多因素的，CPP敏感性通常在小规模筛选早期进行映射，以确定进入高密度操作前的稳健设定点。在灌流目标的高VCD下，这些CPP驱动的偏移转化为抑制性副产物积累（特别是乳酸和铵）的更大风险，可能进一步损害生长并推动代谢干预。重要的是，强化也可能改变产品质量，因此CPP优化必须被视为生产力和质量的联合问题，而不仅仅是滴度练习。例如，将VCD从1.5×10⁷增加到2.0–2.5×10⁷cells mL^-1会使完整mAb从约89%降至约80%。温度是用于管理生长-生产力权衡的常用杠杆。轻度低温（约32℃）抑制增殖，同时增加细胞特异性生产力。在运行上，营养供应通常用细胞特异性灌流速率(CSPR)参数化，在实践中使用推向低(PTL)和推向高(PTH)方法进行限定，并通过带排放灌流(PWB)或稳定灌流(SP)策略实施。在定义条件下，报道的CSPR_min值约为100 pL cell^-1day^-1。与CSPR作为主要进料处理手段的作用一致，从第6天开始结合高灌流率和低温，使滴度增加到约16 g L^-1。总体而言，这些研究推动了控制应力和代谢漂移、管理抑制性副产物以及在灌流高细胞密度下保持CQA同时约束培养基需求的CPP设定点。

2.1.3 培养基和补料

培养基组成和补料决定了CSPR的可行下限、副产物积累的程度以及高细胞密度灌流的经济可行性，因此必须与CPP设定点和截留性能联合优化，因为配方设定了单位灌流液中的营养密度和在给定CSPR下的废物积累耐受性。因此，系统性的培养基优化通常使用结构化实验设计进行。除了通过代谢或细胞周期调节提高生产力外，还研究了包括短链脂肪酸（如戊酸/丙戊酸）、脂质补料或基于尿苷-锰-半乳糖的糖基化控制策略等GMP兼容补料，用于哺乳动物培养中的生产力和质量调整。在实践中，补料选择受制造可接受性约束，必须评估其对CQA的影响以及在灌流相关条件下的长周期稳健性。

2.1.4 长期灌流培养中的细胞系稳定性

从传统补料分批操作过渡到长期灌流培养不仅带来工艺工程挑战，还引发细胞系稳定性问题。由于灌流工艺在稳定的生产条件下维持细胞的时间远长于常规补料分批培养，确保在延长的生产阶段的遗传和表型稳定性对于稳健的上游连续处理至关重要。虽然传统补料分批培养通常运行20天或更短时间，连续灌流培养可在稳定生产条件下维持数月。尽管在细胞系开发过程中选择了单克隆来源，但在放大和长期培养期间可能出现严重的遗传和转录组不稳定性。因此，监管要求从细胞库到补料分批生产规模的至少70代的稳定性验证。仅基于培养天数评估稳定性可能并不恰当，因为在放大期间观察到的指数生长在灌流生产阶段不会持续。然而，在经验证的稳定性限制之外运行会引入工艺不确定性。因此，灌流培养工艺开发可能需要比现有方法长得多的细胞系稳定性评估期。最近，合成生物学被积极整合到细胞系开发流程中，作为克服长期连续工艺局限性的可行解决方案。一个有前景的策略是人为地将细胞生长与产物形成解耦。在CHO细胞中，B淋巴细胞诱导成熟蛋白1(Blimp1)是一个在抑制细胞生长的同时增强蛋白质生产力的因子例子。这种生长/生产解耦策略非常适合灌流培养，一旦达到目标活细胞浓度，期望停止细胞生长并将细胞资源重定向到生产中。更重要的是，在灌流系统长期培养期间人为抑制细胞增殖有助于减轻与延长培养相关的遗传不稳定性和克隆漂移。

2.2 连续下游处理

下游处理(DSP)通常组织为模块化序列，包括初级捕获（如mAb的Protein A亲和捕获）、专用病毒清除（包括病毒灭活和病毒过滤）、一种或多种精纯分离（如离子交换色谱(IEX)或疏水相互作用色谱(HIC)）以及最终调节操作（包括用于浓缩和缓冲液置换的超滤/渗滤(UF/DF)），随后视情况而定进行最终灌装。在连续和集成配置中，这些模块以减少的储池和更严格的界面约束相连接，使得总体性能不仅由单个单元操作的效率决定，还由周期性操作的同步性（包括色谱结合-洗脱循环，以及在多柱格式中的柱间切换时间表）以及跨界面的RTD整形和滞留管理共同决定。多柱色谱是连续捕获和精纯的主要实现平台，通过将固有的循环结合和洗脱行为转化为准连续通量，同时提高树脂利用率。连续UF/DF以及兼容连续模式的病毒清除步骤，随后成为在没有大型暂存罐的情况下维持稳态组成和病毒安全性的关键，其可行性在很大程度上取决于停留时间控制和稳健的界面管理。除了生产率和产品质量外，下游分离序列还必须根据能源使用和环境影响进行评估，因为分离操作可能对工艺层面的二氧化碳排放做出重大贡献。在此背景下，混合建模框架被引入，结合数据驱动的机器学习和机理模型来比较分离技术的能耗和二氧化碳排放。他们的分析表明，技术选择（包括在适当情况下用膜基替代方案取代传统热分离）可使药物纯化案例的平均能耗降低约40%，二氧化碳排放降低高达90%。这些结果表明，可持续性导向的建模可以补充传统的DSP设计标准，特别是当连续下游架构不仅因生产率和稳健性，还因能源和排放表现而被评估时。此外，连续沉淀正在成为一种互补的下游策略，用于生物治疗药物的纯化，特别是在高强度上游工艺加剧色谱容量、树脂成本和可扩展性压力的情况下。以下小节回顾了多柱色谱、连续沉淀、UF/DF和病毒清除作为核心或新兴下游模块的最新进展，这些模块决定了长周期可操作性和端到端产线集成。

2.2.1 多柱色谱

生物制药纯化采用多种色谱模式，包括尺寸排阻色谱(SEC)、IEX、HIC和亲和色谱。在mAb下游处理中，Protein A亲和色谱通常用于初级捕获，随后是IEX或HIC步骤进行精纯。连续操作提高了生产率、树脂利用率和缓冲液效率，同时减小了柱体积，主要是通过在多个柱之间分配结合和洗脱，以最小化闲置时间并提高传质区的利用率。因此，周期性计数器色谱(PCC)、模拟移动床(SMB)、多柱逆流溶剂梯度纯化(MCSGP)和连续逆流切向色谱(CCTC)推动了从分批到连续色谱的转变。一个四柱PCC AAV亲和捕获步骤通过洗脱缓冲液筛选改善了洗脱回收率，实现了>82%的回收率和约3倍的稳态生产率。研究表明，产品和杂质水平的同步波动可能会干扰基于紫外(UV)的控制，推动了包括调节第一柱蛋白输入在内的高级策略。PCC方案也被应用于连续复性，据报道比分批SEC的生产率高6.8倍。SMB色谱被用于纯化2'-O-甲氧乙基核苷亚磷酰胺，纯度为99.6%，通量提高33倍，溶剂消耗降低89%。对于基于梯度的分离，重新设计的MCSGP解决了流速失配问题，在保持>95%纯度的同时将回收率从83.6%提高到97.8%。在一个mAb纯化案例中，回收率达到93.9%。最后，研究表明，上样密度和停留时间共同塑造多柱性能，突出了这些变量作为一致的上下游耦合的关键集成控制点。

2.2.2 连续沉淀

连续沉淀正在成为一种互补的下游策略，用于生物治疗药物的纯化，特别是随着强化上游工艺提高产品滴度并对传统色谱容量施加更大压力。与色谱不同，沉淀依赖于受控的相变而非吸附到固定相，使得产品回收和杂质排斥强烈依赖于局部过饱和度、混合强度、pH、离子强度、反溶剂或沉淀剂添加、RTD和颗粒尺寸演变。这些特征使得沉淀在减少树脂依赖和提高可扩展性方面具有吸引力，但也引入了大量的控制要求。在连续格式中，沉淀通常通过基于流动的混合和受控停留时间的装置实施，其中成核、生长、聚集和分离必须在定义的工艺窗口内发生。这创造了与多柱色谱不同的界面问题。连续沉淀不需要同步结合和洗脱循环，而是需要紧密协调进料组成、沉淀剂添加、混合时间尺度、停留时间和下游固液分离。因此，PAT和基于模型的控制对于监测浊度、颗粒尺寸分布、浓度和杂质携带以及稳定进料波动下的回收率和纯度尤为重要。从端到端连续制造的角度来看，沉淀最好被视为一种新兴的、潜在互补的捕获或中间纯化操作，而不是直接替代已建立的色谱平台。其实际集成取决于对沉淀动力学的稳健控制、沉淀产品的可靠去除或重溶、与后续精纯和病毒清除步骤的兼容性，以及在连续操作下杂质清除