坦桑尼亚科罗格韦（Korogwe）农村地区儿童与鸡源产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum Beta-Lactamase, ESBL）肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）复合体的分子特征研究

《One Health》：Molecular characterisation of extended-Spectrum-Beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae among children and chicken in the rural Korogwe District, Tanzania

　　

摘要：表达超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum Beta-Lactamases, ESBLs）的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是全球重大公共卫生挑战，可感染人类与畜禽。然而，坦桑尼亚人源与畜禽源分离株的分子流行病学及二者关联性尚缺乏深入研究。研究人员旨在通过在坦桑尼亚科罗格韦（Korogwe）地区开展横断面分析以填补该知识空白。研究人员采集腹泻及非腹泻儿童的粪便样本，以及商品化养殖场与散养（smallholder）鸡场的鸡粪便样本，分离肺炎克雷伯菌复合体（K. pneumoniae complex）菌株，筛选ESBL阳性分离株进行表型耐药检测并行全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）。结果显示，腹泻儿童中ESBL阳性肺炎克雷伯菌复合体检出率为14%（n/N＝37/259），非腹泻儿童为7%（n/N＝17/258）；鸡源分离株中，商品化养殖场检出率为10%（n/N＝38/371），散养鸡场为5%（n/N＝21/406）。经测序的ESBL阳性分离株中，73%（n/N＝69/95）为肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae sensu stricto），14%（n/N＝13/95）为类肺炎克雷伯菌准肺炎亚种（K. quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae），13%（n/N＝12/95）为类肺炎克雷伯菌相似肺炎亚种（K. quasipneumoniae subsp. similipneumoniae），1%（n/N＝1/95）为变栖克雷伯菌（K. quasivariicola）。观察到广泛的序列分型（Sequence Type, ST），鉴定出15个克隆一致性聚类，主要集中于同一鸡场来源的鸡源分离株。研究发现68株分离株携带44种不同荚膜血清型（K locus）。blaCTX-M-15是检出率最高的ESBL表达基因。综上，本研究提示研究地区存在人源与鸡源产ESBL肺炎克雷伯菌复合体菌株的种间传播可能性，强调需采取整合的"同一健康（One Health）"策略以遏制坦桑尼亚抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）的传播。

论文解读：坦桑尼亚农村儿童与鸡源产ESBL肺炎克雷伯菌复合体的分子流行病学及潜在种间传播研究

一、研究背景与意义

抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR），特别是产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum Beta-Lactamase, ESBL）肠杆菌目细菌的流行，在撒哈拉以南非洲（Sub-Saharan Africa, SSA）因诊断受限、抗生素滥用等因素尤为严峻。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）复合体是重要的人畜共患条件致病菌及ESBL主要宿主，可致新生儿败血症及社区感染，肠道定植亦可成为耐药基因储备库。尽管坦桑尼亚已报道人源与畜禽源ESBL阳性肠杆菌，但二者间分子水平的传播关联及当地肺炎克雷伯菌复合体的分子流行病学特征尚不清楚，人畜（禽）传播途径多未阐明。该研究由Mbwana JR等开展并发表于《One Health》期刊，通过对坦桑尼亚科罗格韦（Korogwe）地区腹泻/非腹泻5岁以下儿童及商品化与散养鸡场鸡只粪便分离产ESBL肺炎克雷伯菌复合体进行表型药敏与全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）分析，明确菌种组成、序列分型（Sequence Type, ST）、荚膜型（K locus）、耐药/毒力基因及系统发育关系，探讨人禽潜在种间传播可能，为制定区域性One Health防控策略提供分子依据。

二、主要关键技术方法概述

研究于2019年1月至2020年7月在坦桑尼亚科罗格韦地区开展横断面调查，采集517份5岁以下儿童（腹泻259份、非腹泻258份）粪便及777份鸡粪便（商品化农场371份、散养农场406份）。标本经ESBL显色培养基初筛、血琼脂纯化后，使用VITEK 2 Compact系统进行菌种鉴定与抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Testing, AST），并以双纸片协同试验（Double Disc Diffusion Test, DDDT）确认ESBL表型。ESBL阳性株提取基因组DNA行Illumina短读长WGS。生物信息学流程包括AQUAMIS质控与组装、CONFINDR与CheckM2评估污染及完整度；采用CHEWBBACA行核心基因组多位点序列分型（core genome Multilocus Sequence Typing, cgMLST），IQ-TREE构建最大似然法系统发育树，cgMLST差异≤5个位点定义为克隆一致性；应用AMRFinderPlus预测AMR基因，ABRICATE结合VFDB及Kleborate注释毒力因子（如rmpA、rmpA2、耶尔森菌素yersiniabactin等），MOB-SUITE与PlasmidFinder鉴定质粒复制子类型。统计学采用患病率比（Prevalence Ratio, PR）与Bootstrap法评估鸡场水平聚集性。

三、研究结果

3.1 儿童与鸡源肺炎克雷伯菌复合体检出情况

共分析517份儿童粪便与777份鸡粪便。腹泻儿童ESBL阳性肺炎克雷伯菌复合体检出率14%（37/259），高于非腹泻儿童的7%（17/258）；商品化鸡场检出率10%（38/371）高于散养鸡场的5%（21/406），商业场患病风险约为散养场的2.0倍（95% CI＝1.2–3.3）。Bootstrap分析显示商业与散养场内部无显著聚集性感染风险增加。

3.2 儿童与鸡源分离株抗菌药物耐药性表型

所有ESBL阳性分离株对碳青霉烯类（亚胺培南、厄他培南、美罗培南）高度敏感；多数对庆大霉素敏感（人源78%–82%，鸡源81%）；对环丙沙星（人源59%，鸡源73%）、莫西沙星（人源73%–76%，鸡源80%）及复方磺胺甲噁唑（Trimethoprim/Sulfamethoxazole, 人源76%，鸡源73%）呈高耐药率；所有分离株对青霉素类、三代头孢菌素及β-内酰胺酶抑制剂复方制剂表型耐药（符合ESBL表型）。

3.3 肺炎克雷伯菌复合体基因型表征

95株ESBL阳性分离株WGS显示菌种组成为：肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae sensu stricto）69株（73%）、类肺炎克雷伯菌准肺炎亚种（K. quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae）13株（14%）、类肺炎克雷伯菌相似肺炎亚种（K. quasipneumoniae subsp. similipneumoniae）12株（13%）、变栖克雷伯菌（K. quasivariicola）1株（1%）。鉴定出54种独特ST，最常见为ST1040-1LV（10株，均来自同一鸡场）、ST17（6株）、ST469/ST711/ST3108-1LV（各4株）。68株肺炎克雷伯菌 sensu stricto具44种K locus，最常见KL42（10株，同场同源鸡源ST1040-1LV）。人源与鸡源共享部分ST（如ST17），部分ST仅见于鸡（ST1040-1LV、ST3108-1LV等）或部分仅见于人（ST405仅见于腹泻患儿）。

3.4 肺炎克雷伯菌复合体耐药基因型标记

90/95株（95%）携带bla_CTX-M-15（93%定位于质粒），其余含bla_SHV-2A/bla_SHV-2/2A等；75%含bla_TEM-1（93%质粒源），35%含bla_SHV-11（97%染色体源）。氨基糖苷类耐药基因为aph(3″)-Ib与aph(6)-Id（各74%）；喹诺酮耐药以oqxA（86%）、oqxB（53%）及质粒介导qnrS1（62%）为主；fosA（90%）、sul2（81%）、tet(A)（68%）、dfrA14（66%）亦高频检出。bla_CTX-M-15、sul2、tet(A)、bla_TEM-1等主要位于质粒，提示可通过可移动遗传元件（Mobile Genetic Elements, MGEs）水平转移。

3.5 系统发育分析与克隆关系

cgMLST进化树识别15个克隆一致性聚类（≤5个等位基因差异）：9个仅含鸡源分离株（ST34、ST469等），3个为人–鸡跨种共享聚类（含ST17、ST1471-LV、ST2938），3个仅含人源（ST405、ST482、ST2136）。大多克隆扩增（>2株）发生于同一鸡场鸡源，如ST1040-1LV形成10株同场克隆簇，证实鸡场内克隆传播。

3.6 毒力因子分析

未检出典型高毒力肺炎克雷伯菌（hypermucoid K. pneumoniae, hvKP）标志基因rmpA、rmpA2及气杆菌素（aerobactin）、沙门菌素（salmochelin）。少数株（15株）携带耶尔森菌素（yersiniabactin, ybt）相关基因簇（fyuA、irp1、ybtS等）。KL2荚膜型（关联高毒力）偶见于3株人源（ST25、ST14），其中ST14来源于腹泻患儿。

四、讨论与结论翻译

讨论指出：本研究人禽ESBL阳性率与SSA其他地区相近，商品化鸡场较高检出率提示养殖密度与抗菌药暴露影响播散；腹泻患儿定植率更高支持胃肠紊乱与耐药肠杆菌定植关联；bla_CTX-M-15在人源与鸡源中占绝对主导，印证东非ESBL肠杆菌中该基因的核心地位及共同耐药库存在；cgMLST揭示部分ST跨人–鸡共享提示潜在种间传播，但多数克隆限于单一宿主，需谨慎解读方向性；未见典型高毒力基因，KL42克隆扩增提示鸡场内部克隆传播维持耐药株存续；受限于短读长测序、横断面设计及未纳入环境样本，无法明确传播方向与具体机制，建议未来开展整合人–动物–环境的纵向One Health研究。

结论：本研究阐明了坦桑尼亚儿童与鸡源产ESBL肺炎克雷伯菌复合体的分子流行病学特征。ESBL型β-内酰胺酶谱系及共有耐药基因的存在提示人源与鸡源菌株间存在潜在种间传播，强调需采取整合的同一健康（One Health）策略以遏制该地区抗菌药物耐药性的传播。