通过CRISPR/Cas9系统生成的Pi21功能缺失等位基因可提高水稻的抗稻瘟病能力

《Plant Gene》：Pi21 loss-of-function alleles generated by CRISPR/Cas9 system improves blast resistance in rice

　　

Nuttapong Monthatong|Jirawat Raungnet|Teerapong Janthabut|Srikanjana Klayraung|Saengtong Pongjaroenkit|Chatsuda Phuakjaiphaeo|Chatchawan Jantasuriyarat|Krisana Lanumteang|Supachai Vuttipongchaikij|Chotipa Sakulsingharoj

泰国清迈50290，湄乔大学理学院遗传学专业

摘要

由稻瘟病菌引起的稻瘟病至今仍难以控制，因为针对特定菌株的R基因会迅速被克服。Pi21是一种非典型的易感基因，它编码一种富含脯氨酸的蛋白质，该蛋白质具有潜在的金属结合域和蛋白-蛋白相互作用区域，其功能缺失等位基因能提供持久且非菌株特异性的抗性。在此，我们首先对8种具有不同稻瘟病反应的水稻品种的Pi21基因进行了测序，未发现已知的21或48碱基对的抗性单倍型，这为在籼稻背景下对Pi21进行新基因编辑提供了可能。我们设计了5个针对Pi21第1外显子和第二外显子的CRISPR/Cas9载体，并将其导入籼稻品种Kasalath中。所有靶点都实现了编辑，T1代植株经分离后得到了纯合的、不含Cas9的品系，这些品系要么在富含脯氨酸的区域存在提前移码突变，要么存在30碱基对的框内缺失。使用3种稻瘟病菌分离株进行的叶片离体试验表明，导致氨基酸25或180处出现提前终止密码子的移码等位基因能持续减少病斑长度和面积，而框内缺失则能带来中等程度的抗性。具有更强抗性的编辑品系在接种后48小时内，SA途径以及JA/乙烯响应防御基因如PR1b、WRKY45和PAL的表达也更为活跃，这说明Pi21通常会抑制多种免疫途径。对8个与产量相关的性状的农艺评估显示，大多数编辑品系的产量与野生型Kasalath相当。综上，这些数据表明Pi21的功能破坏与籼稻抗性表型的增强之间存在结构层面的关联，同时也证明精确破坏这一易感基因能够带来广谱的稻瘟病抗性，且不会对产量造成显著影响。

引言

由稻瘟病菌引起的稻瘟病仍是危害水稻最严重的病害之一，在正常情况下会导致10%–30%的产量损失，在有利条件下甚至可达50%（Nalley等人，2016；Skamnioti和Gurr，2009）。控制稻瘟病的一个主要挑战在于病原体的快速进化，它会通过不断拓展效应子库来克服基于单一、菌株特异性R基因的抗性（Jones和Dangl，2006；Nguyen等人，2015；Oliveira-Garcia等人，2024）。尽管目前已鉴定出100多个稻瘟病抗性基因，其中许多也被克隆出来，但它们在田间环境中的抗性效果往往很短暂（Nguyen等人，2015；Pedrozo等人，2025）。

为解决这一问题，育种策略越来越注重可持续的、非菌株特异性的抗性来源，包括数量抗性基因位点和宿主易感基因（S基因）（Fukuoka和Okuno，2001；Fukuoka等人，2009；Yasuda等人，2015）。与传统的R基因不同，S基因编码的是病原体可以利用的宿主因子，破坏这些基因能够带来广谱抗性，同时还能降低对病原体种群的选择压力（Fukuoka等人，2009；Angels-Shim等人，2020）。CRISPR/Cas9等基因组编辑技术为在S基因中产生功能缺失等位基因提供了高效方法，无需考虑连锁拖累问题，也不需要长时间回交，近期研究已表明，编辑单个或多个S基因能够在水稻中带来广谱、多病原体抗性（Tao等人，2021；Sha等人，2023；Huang等人，2024；Younas等人，2024）。”

Pi21是一种极具前景的S基因靶标。与大多数已被克隆的稻瘟病抗性基因不同，Pi21不编码NLR蛋白，而是编码一种胞质内的富含脯氨酸的蛋白质，该蛋白质具有潜在的金属结合域和蛋白-蛋白相互作用结构（Fukuoka等人，2009；Angels-Shim等人，2020）。显性的Pi21等位基因会增强易感性，而隐性的功能缺失等位基因则能带来部分、持久的、通常是非菌株特异性的抗性（Fukuoka等人，2009；Fukuoka和Okuno，2019）。最初在粳稻和旱稻品种中发现了含有21或48碱基对缺失的自然pi21单倍型，由于它们与影响谷物品质的基因位点紧密连锁，传统上限制了这类基因的引入。此后，随着标记辅助选择技术和精细基因位点改良技术的发展，人们已经能够在不影响谷物品质的情况下将pi21引入某些优质水稻品种中（Fukuoka等人，2009；Fukuoka等人，2015；Feng等人，2019）。直接在优质籼稻品系或模式籼稻品系中对Pi21进行编辑，则是一种可以规避上述连锁限制的替代策略。

目前已有研究表明，通过CRISPR/Cas9敲除Pi21能够在多种遗传背景中提升稻瘟病抗性，包括VP1636、Longke638S以及易感品系58B，而且不会对植株高度、分蘖数、穗长、粒数或千粒重造成显著影响（Nawaz等人，2020；Zhou等人，2022；Yang等人，2023）。这些研究还发现，感染后水杨酸途径和茉莉酸途径中的防御相关基因表达会上调，这说明Pi21与其他被编辑的S基因如Bsr-d1、OsERF922、OsDjA2、OsERF104、OsSEC3A和OsJaz4类似，都是水稻多种免疫途径的负调控因子（Wang等人，2016；Ma等人，2018；Nawaz等人，2020；Távora等人，2022；Tao等人，2021；Zhou等人，2022；Zhang等人，2024）。不过，目前关于Pi21的功能研究大多是在粳稻或杂交不育品系中进行的。在东南亚种植的籼稻品种，包括那些被用作遗传学研究模型的品种，很少携带天然的21或48碱基对的pi21缺失。我们的调查显示，泰国的一些品种如Jao Hom Nin和Hahng Yi 71的抗性很可能是由其他基因位点决定的，比如Pi7-J或< />-J（Chaipanya等人，2017），而Pi21在籼稻背景下仍是一个未被利用的靶标。这为通过靶向基因组编辑生成新的功能缺失等位基因提供了机会。

在本研究中，我们以籼稻品种Kasalath为材料，探讨针对Pi21特定结构域的破坏是否能够带来广谱的稻瘟病抗性。我们测序了多个品种的Pi21编码区，确认不存在天然的抗性单倍型，随后设计了针对第1外显子和第二外显子的CRISPR/Cas9载体，并培育出了独立的编辑品系。我们测试了这些品系对多种稻瘟病菌分离株的抗性，分析了防御基因的表达情况，同时还评估了它们的农艺表现。我们的目标是把Pi21中特定结构域的突变与籼稻背景下的抗性表型以及后续的防御反应联系起来。

在本研究中，我们同样以籼稻品种Kasalath为材料，测试针对Pi21特定结构域的破坏是否能够再现粳稻中所观察到的广谱、部分性的稻瘟病抗性。我们测序了多个品种的Pi21编码区，确认不存在天然的抗性单倍型，随后设计了针对第1外显子或第二外显子的CRISPR/Cas9载体，并培育出了独立的编辑品系。我们测试了这些品系对3种稻瘟病菌分离株的病害反应，分析了感染后关键的SA途径和JA/乙烯途径标志基因的表达情况，同时还测量了8个农艺性状，以判断这些编辑品系是否仍能保持正常的产量水平。我们的目标是把Pi21中特定的突变类型与稻瘟病抗性程度、防御途径的激活情况以及农艺表现联系起来。

章节节选

Pi21/pi21基因在抗病和感病水稻品种中的序列分析

我们采用改进的CTAB方法，从8个水稻品种的幼叶中提取基因组DNA，这8个品种包括6个籼稻品种（Jao Hom Nin、Hahng Yi 71、KDML105、RD-MJU2、RD6和Kasalath）以及2个粳稻品种（Nipponbare和Kitaake）。使用基因特异性引物通过PCR扩增Pi21/pi21基因（见补充表S1），预期得到的扩增片段长度约为1537碱基对。PCR反应（20微升）是使用Phusion Flash高保真聚合酶进行的（Thermo Scientific，

水稻品种中Pi21的序列变异

为了研究具有不同稻瘟病反应的水稻品种中Pi21的等位基因多样性，我们对8个品种的完整编码区（从起始密码子到终止密码子）进行了PCR扩增并随后进行Sanger测序，这8个品种分别是：Jao Hom Nin、Hahng Yi 71、KDML105、RD6、RD-MAEJO2、Kasalath、Nipponbare和Kitaake。引物是根据RAP-DB中的Pi21参考序列（Os04g0401000）以及Aichi-asahi品种中的感病等位基因（GenBank登录号AB430852）设计的。编码区的序列比对结果显示

讨论

对8个水稻品种中的Pi21序列进行比较后，发现其编码结构具有保守性，功能多样性有限。在抗病品种（Jao Hom Nin、Hahng Yi 71）和感病品种（KDML105、RD6、RD-MAEJO2、Kasalath）中都检测到了一个重复出现的9碱基对框内缺失，这说明该变异无法用于判断抗性。这些品种中都没有出现之前报道过的、能够使Pi21功能丧失并带来持久部分抗性的21或48碱基对缺失（

CRediT作者贡献声明

Nuttapong Monthatong：撰写——初稿撰写，正式分析，数据整理。Jirawat Raungnet：正式分析，数据整理。Teerapong Janthabut：撰写——审阅与编辑，正式分析，数据整理。Srikanjana Klayraung：撰写——审阅与编辑，数据整理。Saengtong Pongjaroenkit：正式分析，数据整理。Chatsuda Phuakjaiphaeo：正式分析，数据整理。Chatchawan Jantasuriyarat：撰写——审阅与编辑，正式分析。Krisana Lanumteang：正式分析。

关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本研究成果时，作者使用了ChatGPT进行语言编辑和校对。在使用该工具/服务之后，作者对内容进行了必要的审阅和修改，并对论文的内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了泰国科学研究与创新机构（TSRI）通过湄乔大学2024年度基础基金（编号MJ.1-67-05-001）的支持。此外，卡塞萨特大学研究与开发研究所的KURDI项目也为本项目提供了资金支持，项目编号为FF(KU-SRIU)22.67。