BolMYB122-BolTGG1模块通过加速硫代葡萄糖苷水解产生萝卜硫素增强西兰花盐胁迫耐受性

《Plant Physiology and Biochemistry》：BolMYB122-BolTGG1 module enhances salt stress tolerance via accelerating the hydrolysis of glucosinolates to produce sulforaphane in broccoli

　　

硫代葡萄糖苷（glucosinolates, GSLs）是一类主要富集于十字花科植物的次生代谢产物，在环境胁迫响应中发挥重要作用。然而，GSLs在西兰花应对盐胁迫中的功能及调控机制尚不清楚。本研究在西兰花中鉴定到BolTGG1，其为主要功能为水解GSLs的β-硫代葡萄糖苷葡糖水解酶（β-thioglucoside glucohydrolase, TGG）基因家族成员。盐胁迫下BolTGG1表达上调。过表达BolTGG1显著提高了西兰花和拟南芥的盐胁迫耐受性。随后，研究人员将BolTGG1在酵母中异源表达并分离BolTGG1蛋白以评估其水解GSLs的能力。结果证实，外源添加BolTGG1可在体外明显增加GSLs的主要水解产物——萝卜硫素（sulforaphane, SFN）的产量。同时，BolTGG1过表达转基因西兰花植株中SFN含量显著升高。研究人员进而探究了SFN在盐胁迫响应中的作用。结果表明，外源施加SFN可直接增强西兰花的抗盐性，伴随超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和过氧化物酶（peroxidase, POD）活性升高，以及丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平降低。此外，研究人员确认BolMYB122是BolTGG1的上游调控转录因子，BolMYB122正调控BolTGG1的转录。综上，这些结果表明BolMYB122-BolTGG1模块主要通过加速SFN的生成赋予盐胁迫耐受性。该发现为GSLs代谢物在植物盐胁迫响应中的作用及调控机制提供了新见解，并从调控植物次生代谢的角度提出了一种新的抗逆育种策略。

**论文解读：BolMYB122-BolTGG1模块通过加速硫代葡萄糖苷水解产生萝卜硫素增强西兰花盐胁迫耐受性**

**研究背景**
土壤盐渍化已成为全球作物生产的主要限制因素之一。盐胁迫通过诱导渗透胁迫、离子失衡和氧化损伤显著影响植物的生长、发育和产量。为应对环境胁迫，植物进化出包括次生代谢物生物合成与积累在内的多种适应机制。硫代葡萄糖苷（glucosinolates, GSLs）是一类富含氮和硫的次生代谢物，主要存在于十字花科植物中，在调节植物对盐胁迫的响应中发挥关键作用。已有研究表明，GSLs通过调节水分运输和水通道蛋白维持西兰花的细胞水合与离子平衡，并在拟南芥中与活性氧（reactive oxygen species, ROS）协同作用以平衡细胞胁迫并减轻细胞毒性。然而，GSLs在盐胁迫耐受性中的功能及调控机制仍不清楚。TGGs（又称黑芥子酶，myrosinases，EC 3.2.1.147）属于糖苷水解酶超家族1（glycoside hydrolase superfamily 1, GH1），主要功能是水解GSLs产生多种生物活性产物，如异硫氰酸酯（isothiocyanates, ITCs）、硫氰酸酯、腈类和环硫腈类。其中，TGG1和TGG2是核心酶，且TGG1的比活力比TGG2高约40%。TGG1在生物胁迫（如抗病和抗虫）及非生物胁迫（如干旱）中的作用已有报道，但其在盐胁迫响应中的功能与调控机制尚不明确。西兰花（*Brassica oleracea* var. *italica*）是一种重要的经济蔬菜，富含萝卜硫素（sulforaphane, SFN）等生物活性化合物，但多数品种对盐敏感。因此，阐明西兰花盐胁迫响应的分子机制对于通过遗传工程培育耐盐新品种具有重要意义。本研究旨在鉴定西兰花中调控GSLs水解的关键基因并揭示其在盐胁迫耐受性中的作用及调控机制。

**研究内容与结论**
研究人员发现，BolTGG1（一个编码黑芥子酶的基因）在盐胁迫下表达显著上调。通过获得BolTGG1过表达（BolTGG1-OE）和RNA干扰（BolTGG1-RNAi）转基因西兰花及过表达转基因拟南芥，证实过表达BolTGG1显著增强了盐胁迫耐受性。在酵母中异源表达BolTGG1并分离其蛋白，证实BolTGG1可水解GSLs产生SFN。BolTGG1过表达转基因西兰花中内源SFN含量显著升高，而RNAi株系中SFN含量降低。外源施加SFN可直接增强西兰花的抗盐性，表现为超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性升高，丙二醛（MDA）水平降低。此外，研究人员通过酵母单杂交（Y1H）、GUS转录活性分析和双荧光素酶报告（DLR）实验确认，转录因子BolMYB122可直接结合BolTGG1启动子并正调控其转录。BolMYB122过表达转基因西兰花表现出更强的盐耐受性，而RNAi株系则更敏感。这些结果表明，BolMYB122-BolTGG1模块通过加速GSLs水解产生SFN，进而通过增强抗氧化酶活性（如SOD和POD）减轻ROS损伤，从而赋予西兰花盐胁迫耐受性。该研究论文发表在《Plant Physiology and Biochemistry》。

**主要关键技术方法**
本研究采用同源比对和系统发育分析鉴定BolTGG1基因；利用农杆菌介导的转化法（花序浸染法用于拟南芥，外植体组织培养体系用于西兰花）获得转基因植株；通过qRT-PCR分析基因表达模式；在毕赤酵母中异源表达BolTGG1蛋白并利用SDS-PAGE检测；采用高效液相色谱（HPLC）检测SFN含量；通过DAB和NBT组织化学染色评估ROS积累；测定SOD、POD活性和MDA水平；采用酵母单杂交（Y1H）、GUS转录活性分析和双荧光素酶报告（DLR）实验验证转录调控关系。样本材料包括西兰花品种KJ-18（保存于天津科润蔬菜研究所）和拟南芥Col-0生态型。

**研究结果**

**3.1 BolTGG1的克隆与序列特征**
以AtTGG1为查询序列，通过局部BLAST分析在西兰花基因组中鉴定到8个候选TGG1基因。系统发育分析显示AtTGG1与所有8个候选基因聚于同一分支。基于转录表达数据，表达量最高的基因（ID: GWHPEQVJ009804）被命名为BolTGG1。序列分析表明BolTGG1编码区全长1647 bp，包含12个外显子，编码548个氨基酸，与其他十字花科物种的TGG1具有保守结构域和10个保守基序，但与AtTGG1的序列一致性约为82%，提示其核心功能保守但可能已发生功能分化。

**3.2 BolTGG1正向响应盐胁迫**
qRT-PCR分析显示，盐胁迫处理后BolTGG1转录水平在3小时迅速显著升高，6小时达峰值；干旱胁迫下响应较弱且延迟；黑腐病菌（*Xanthomonas campestris* pv. *campestris*, Xcc）感染下虽也显著上调但诱导幅度和峰值远低于盐胁迫。表明BolTGG1对盐胁迫呈现快速且强烈的正向响应。

**3.3 过表达BolTGG1显著增强转基因西兰花和拟南芥的盐胁迫耐受性**
盐胁迫处理12天后，BolTGG1-RNAi西兰花出现严重的叶片卷曲、黄化和脱落；BolTGG1-OE西兰花叶片卷曲最轻、黄化最不明显。过表达BolTGG1的拟南芥同样比野生型（WT）表现出更强的耐盐性。DAB和NBT染色显示BolTGG1-OE植株叶片中H₂O₂和O₂^?积累较RNAi和WT植株更少，表明其抗氧化能力增强。

**3.4 BolTGG1是水解GSLs产生SFN的关键酶**
在毕赤酵母中成功异源表达BolTGG1，获得约64 kDa的蛋白。将含BolTGG1的酵母提取物加入GSLs提取体系后，SFN含量显著高于对照。证实BolTGG1具有水解GSLs产生SFN的酶活性。

**3.5 过表达BolTGG1显著提高西兰花内源SFN含量**
BolTGG1-OE西兰花中SFN含量约为WT的2倍，而BolTGG1-RNAi株系中SFN含量显著降低。盐胁迫下非转基因西兰花中SFN含量急剧上升，12小时达峰值（0.65 mg·g^-1）。盐胁迫下BolTGG1-OE株系SFN含量最高达WT的5.85倍，而RNAi株系显著低于WT。

**3.6 外源施加SFN显著增强西兰花抗盐性**
外源SFN处理可延缓盐胁迫下西兰花叶片黄化，9天后SFN处理组叶片仍保持绿色而对照严重黄化。生理指标测定显示，外源SFN处理显著提高了SOD和POD活性，降低了MDA水平。类似地，盐胁迫下BolTGG1-OE西兰花比WT具有更高的SOD和POD活性及更低的MDA水平。外源施加GSLs前体——萝卜硫苷（Glucoraphanin, GRA）后，BolTGG1-OE叶片黄化最轻，RNAi叶片黄化最严重。

**3.7 BolMYB122激活BolTGG1的表达**
BolMYB122在盐胁迫下表达显著上调，与BolTGG1表达模式一致。酵母单杂交（Y1H）实验证实BolMYB122可直接结合BolTGG1启动子。GUS转录活性分析显示BolMYB122能激活BolTGG1启动子驱动的GUS表达。双荧光素酶报告（DLR）实验进一步证实BolMYB122显著增强ProBolTGG1::LUC的相对荧光素酶活性。BolMYB122-OE西兰花叶片盐胁迫损伤较轻，而BolMYB122-RNAi叶片损伤更严重。

**讨论与结论**
研究表明，TGG1通过水解GSLs在植物生物和非生物胁迫响应中发挥重要作用。本研究证实盐胁迫显著诱导BolTGG1表达，其过表达增强了西兰花和拟南芥的耐盐性，与SFN积累增加密切相关。SFN是GSLs水解的主要产物之一，外源施加SFN可通过提高SOD和POD活性、降低MDA水平直接增强抗盐性，这突出了SFN在抗氧化和减轻ROS损伤中的关键作用。此外，转录因子BolMYB122被证实直接正调控BolTGG1的表达，且其自身也受盐胁迫诱导。因此，BolMYB122-BolTGG1模块通过加速GSLs水解产生SFN，进而激活抗氧化酶系统（如SOD和POD）以清除ROS损伤，赋予西兰花盐胁迫耐受性。
**结论翻译**：BolTGG1是西兰花中水解GSLs产生SFN的关键黑芥子酶，在盐胁迫下表达被诱导。过表达BolTGG1显著提高了转基因西兰花的盐耐受性及SFN积累。外源施加SFN可升高SOD和POD活性并降低MDA水平，从而提高西兰花的盐胁迫耐受性。此外，BolMYB122被证实直接正调控BolTGG1，其表达也受盐胁迫诱导。这些结果表明，BolMYB122-BolTGG1模块主要通过加速SFN的生成来升高抗氧化酶（如SOD和POD）活性以减轻氧化损伤，从而赋予盐胁迫耐受性。该发现为GSLs代谢物在植物盐胁迫响应中的作用及调控机制提供了新见解，并为通过靶向调控植物次生代谢来增强耐盐性提供了一种新的育种策略。