微管相关蛋白RIC1形成生物分子凝聚体以促进体外微管束的聚合

《Plant Physiology and Biochemistry》：The microtubule-associated protein RIC1 forms biomolecular condensates to promote the polymerization of microtubule bundles in vitro

　　

拟南芥（Arabidopsis thaliana）RIC1是ROP（Rho GTPase of Plants）交互性CRIB基序含蛋白家族的关键成员，已被定性为植物特异性微管相关蛋白。研究人员认为RIC1作为小GTP酶Rho-of-Plant 6（ROP6）的关键下游效应器，协调有序皮层微管阵列的形成，并促进子叶或叶表皮铺路细胞的交错生长模式。然而，控制RIC1在微管组织调节中功能的精确物理化学特性仍不清楚。在此，研究人员证明RIC1是一个预测的内在无序蛋白，形成生物分子凝聚体（biomolecular condensates），这些凝聚体在体外促进微管束的聚合。在拟南芥子叶铺路细胞中，RIC1形成明显的凝聚体样斑点，其中特定子集直接与皮层微管关联。在体外大分子拥挤条件下，RIC1自组装成独特的球形凝聚体。值得注意的是，这些RIC1凝聚体在体外与微管蛋白（tubulin）共凝聚。研究人员进一步证明，RIC1凝聚体提高局部微管蛋白浓度，与增强的微管成核相关，并在体外促进微管束的聚合。此外，生长的微管束主动重塑这些凝聚体。因此，RIC1凝聚体可能提供一个专门的微环境，使微管蛋白隔离，同时调节体外的微管成核和聚合。这项研究为微管相关蛋白RIC1的生物分子凝聚特性提供了关键见解，为未来研究其体内功能机制奠定了基础。

**研究背景与问题**
微管（microtubules）由α-和β-微管蛋白异二聚体组成，在细胞分裂、扩张、形态发生、迁移和细胞内运输等基础生物学过程中发挥关键作用。植物细胞缺乏中心体，微管成核和聚合在细胞皮层、质膜下和沿预先存在的微管进行，依赖于γ-微管蛋白环复合体（γTuRC）等经典成核因子。然而，植物细胞如何利用含内在无序区（intrinsically disordered region, IDR）的蛋白质局部成核微管仍不清楚。相分离（phase separation）是形成生物分子凝聚体（biomolecular condensates）的关键机制，而RIC1（ROP-interactive CRIB motif-containing 1）被鉴定为ROP GTPase的下游效应器和微管相关蛋白，调控微管切断和铺路细胞形态发生，但其功能的物理化学特性未知。因此，研究人员开展本研究，旨在揭示RIC1是否通过生物分子凝聚调控微管束聚合。

**研究内容与结论**
研究人员发现RIC1是预测的内在无序蛋白，在拟南芥子叶表皮铺路细胞中形成凝聚体样斑点，部分与皮层微管关联；在体外大分子拥挤条件下自组装成球形凝聚体，这些凝聚体与微管蛋白共凝聚，提高局部微管蛋白浓度，促进微管成核和微管束聚合，而生长中的微管束主动重塑凝聚体。该研究揭示了RIC1凝聚体作为微管束聚合平台的新机制，为理解植物细胞微管组织调控提供了重要基础。论文发表在《Plant Physiology and Biochemistry》。

**主要关键技术方法**（不超过250字）
研究人员使用了以下关键技术方法：①PONDR-VSL2和IUPred2A算法预测RIC1蛋白无序区；AlphaFold 3预测蛋白质结构；CIDER分析净电荷分布；PLAAC预测朊病毒样结构域。②构建转基因拟南芥株系（pRIC1::RIC1-EGFP、pRIC1::mEGFP-RIC1、pRIC1::mRFP-RIC1）在ric1-1突变体背景下，利用共聚焦显微镜观察亚细胞定位；FRAP（fluorescence recovery after photobleaching）分析凝聚体动态；1,6-己二醇处理检测凝聚体溶解。③体外蛋白表达纯化（大肠杆菌BL21(DE3)），Ni-NTA亲和层析；体外凝聚体形成实验（使用PEG-8000、葡聚糖、Ficoll等拥挤剂）；体外微管蛋白共凝聚和微管束聚合实验（使用猪脑α/β-微管蛋白异二聚体、GTP）。④BiFC和体外pull-down检测自相互作用。样本来源：拟南芥Col-0和WS生态型，烟草（本氏烟）瞬时表达。

**研究结果**（保留每个小标题，简要说明通过什么研究得出什么结论）

**3.1 RIC1 forms condensates in cotyledon epidermal pavement cells**
通过共聚焦显微镜观察pRIC1::RIC1-EGFP等转基因株系，发现RIC1在子叶铺路细胞中形成明亮的斑点状结构；FRAP实验显示光漂白后约30%荧光在1分钟内恢复，斑点可融合和分裂，且对1,6-己二醇处理敏感，表明RIC1斑点具有生物分子凝聚体的液体样特性。

**3.2 RIC1 condensates associate with cortical microtubules in epidermal pavement cells**
通过共表达pRIC1::RIC1-EGFP和mCherry-TUA5的拟南芥株系，共定位分析（Pearson系数0.36±0.07，Manders系数M1=0.66±0.11，M2=0.54±0.07）显示RIC1斑点与皮层微管部分关联；3D旋转视频和时序成像表明部分RIC1斑点定位于微管成核位点；抑微管剂oryzalin处理不破坏RIC1斑点，但清洗后新生成的微管与RIC1斑点部分共定位，提示RIC1凝聚体可作为微管成核位点。

**3.3 RIC1 is predicted to harbor an IDR and exhibits self-interaction capacity**
PONDR-VSL2和IUPred2A预测RIC1含C端内在无序区（IDR，氨基酸41-224）；PLAAC预测含短朊病毒样结构域（PrLD）；CIDER显示不均匀电荷分布。AlphaFold 3预测RIC1自相互作用通过N端区域；体外pull-down（MBP-RIC1拉下His-RIC1）和BiFC（烟草瞬时表达）证实RIC1在体外和体内均可自相互作用。

**3.4 RIC1 undergoes self-assembly to form spherical condensates in vitro**
纯化的His₆-RIC1和His₆-mRFP-RIC1在含10% PEG-8000的缓冲液中形成球形凝聚体，大小随蛋白浓度和拥挤剂浓度增加而增加；凝聚体可快速融合并松弛成更大液滴，FRAP显示部分荧光恢复，表明液体样性质；His₆-mRFP-RIC1-IDR（氨基酸61-224）也能形成凝聚体，IDR可能驱动凝聚。

**3.5 RIC1 condensates co-condense with tubulin in vitro**
将罗丹明标记的α/β-微管蛋白二聚体加入预形成的GFP-RIC1凝聚体中（无GTP），微管蛋白分布进入RIC1凝聚体形成共凝聚；分配系数（PC）随微管蛋白浓度升高而下降，表明RIC1结合位点饱和；微管蛋白信号强度随浓度上升，表明RIC1凝聚体主动招募微管蛋白。

**3.6 RIC1 condensates may function as nucleators for the growth of microtubule bundles in vitro**
在无凝聚诱导缓冲液中，His₆-GFP-RIC1与紫杉醇稳定的微管共孵育形成致密网状束；在含GTP和微管蛋白的体系中，预形成的mRFP-RIC1凝聚体经历从球形到杆状的变形，并随时间延伸；罗丹明染色显示微管在凝聚体内成核并形成星状体和束；对照FCA-PrLD凝聚体虽能共凝聚微管蛋白但不驱动微管聚合，表明RIC1具有特异性成核活性。

**总结讨论与结论**
讨论部分总结：RIC1含预测IDR，可在体内外自组装成凝聚体，具有球形形态、融合能力和动态分子交换。体内RIC1斑点与体外球形凝聚体形态差异源于细胞内异质环境、机械力、组分多样性等。基于体外实验提出模型：RIC1凝聚体浓缩微管蛋白，超越成核临界浓度，驱动微管束聚合，类似tau凝聚体机制；RIC1通过IDR和自关联能力促进相分离和微管交联。研究局限性包括：微管束变形凝聚体的生物物理机制未完全解析；体内生理相关性需验证；ROP6调控未知。与γTuRC可能协同工作：RIC1凝聚体可能招募γTuRC和微管蛋白提高成核效率，切断后微管末端促进后续束化，形成自强化循环。

**翻译研究结论部分**：因此，RIC1凝聚体可能提供一个专门的微环境，使微管蛋白隔离，同时在体外调控微管成核和聚合。这项研究为微管相关蛋白RIC1的生物分子凝聚特性提供了关键见解，为未来研究其体内功能机制奠定了基础。