烟酰胺和胆固醇添加于冷冻保存前对绵羊精液质量及其受精潜能的影响

《Reproductive Biology》：Effect of addition of nicotinamide and cholesterol before cryopreservation on the quality of sheep semen and its fertilizing potential

　　

摘要：本研究评估了单独或联合添加烟酰胺(nicotinamide, NAM)与胆固醇(cholesterol)至Tris–卵黄(egg yolk)稀释液(extender)中，对公羊(ram)精子冷冻解冻后(post-thaw)质量及受精潜能(fertilizing potential)的影响。采集6只公羊的射精精液(ejaculates)，分别采用不同处理方案（对照组、胆固醇组、NAM 30 μM组、NAM 60 μM组、NAM 30 μM + 2 mg胆固醇组及NAM 60 μM + 2 mg胆固醇组）进行冷冻保存并于解冻后分析。研究人员检测了精子运动特征(kinematics)、形态学、质膜与顶体完整性(acrosome integrity)、线粒体活性(mitochondrial activity)、DNA碎片化(DNA fragmentation)及氧化应激(oxidative stress)，上述指标未受各处理显著影响。然而，30 μM NAM组、60 μM NAM组以及NAM 30 μM联合2 mg胆固醇组较对照组获得了更高的胚胎卵裂率(embryo cleavage rates)。综上所述，补充NAM（单独或与胆固醇联用）不影响大多数解冻后精子质量参数，但部分处理与较高的卵裂率相关。

论文解读：烟酰胺和胆固醇添加于冷冻保存前对绵羊精液质量及其受精潜能的影响

该研究发表于《Reproductive Biology》。

一、研究背景与目的

精液冷冻保存(semen cryopreservation)是动物生殖生物技术的重要基石，但冻融过程会引发精子脂质过氧化(lipid peroxidation)、氧化应激(oxidative stress)、凋亡及DNA碎片化。公羊精子因质膜胆固醇/磷脂比值(cholesterol-to-phospholipid ratio)低，膜稳定性差，对冷冻损伤(cryoinjury)尤为敏感。既往研究表明，胆固醇可嵌入质膜降低通透性并稳定膜流动性，烟酰胺(nicotinamide, NAM)作为维生素B3的水溶性衍生物及NAD?/NADP?前体具有抗氧化及维持线粒体功能的作用，但二者联用在绵羊精液冷冻中是否具互补或协同效应尚不清楚。因此，研究人员旨在评价冷冻稀释液中添加NAM（30 μM和60 μM）单独或联合胆固醇(2 mg)对公羊精子解冻后质量及体外受精(in vitro fertilization, IVF)潜能的影响。

二、主要技术方法

研究人员选用6只性成熟未定性品种公羊，每周采精2次、连续3周，每头公羊获6份射精精液(ejaculates)。实验采用6×6拉丁方设计(Latin square design)，设6个处理组：对照(无添加)、2 mg胆固醇(CHOL)、30 μM NAM(NAM30)、60 μM NAM(NAM60)、NAM30+2 mg胆固醇(NAM30+CHOL)、NAM60+2 mg胆固醇(NAM60+CHOL)。精液经Tris–卵黄稀释液稀释处理后平衡降温至5 ℃、装入0.25 mL细管(straws)经液氮蒸气冷冻后浸于液氮保存，24 h后37 ℃水浴30 s解冻。解冻后检测总活力与前进运动(progressive motility，计算机辅助精子分析 CASA)、质膜功能性(低渗膨胀试验 HOST)、质膜完整性(碘化丙啶 PI/ Hoechst 33342)、顶体完整性(花生凝集素 FITC-PNA + PI)、线粒体活性(罗丹明123 Rhodamine 123)、DNA完整性(甲苯胺蓝 toluidine blue)、氧化应激(TBARS测MDA)。另收集屠宰场绵羊卵巢行卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, IVM)，经Percoll梯度分离复苏精子行体外受精(IVF)及48 h胚胎体外培养，记录卵裂率(cleavage rate)。统计学采用ANOVA及卡方检验，P<0.05为差异显著。

三、研究结果

3.1. Sperm motility（精子运动能力）

解冻前后各组间总活力和前进运动百分比均无显著差异(P>0.05)，表明NAM与/或胆固醇添加未改善冷冻后精子运动参数。

3.2. Membrane functionality（质膜功能性/HOST）

冻融后各组HOST阳性精子比例均较新鲜精液下降(P<0.05)，但各处理组与对照组间无显著差异，说明添加物未额外保护低渗诱导的尾卷曲反应。

3.3. DNA Integrity（DNA完整性）

冻后DNA完整率低于新鲜精液(P<0.05)，但所有处理组与对照组间无显著差异，提示所试NAM浓度未能在冻存条件下显著降低DNA碎片化。

3.4. Evaluation of plasma membrane integrity and mitochondrial activity（质膜完整性与线粒体活性）

解冻后质膜完整性(plasma membrane integrity, PMI)及线粒体活性(mitochondrial activity, MA)在各组间无统计学差异(P>0.05)。

3.5. Evaluation of acrosome reaction（顶体完整性）

活精子具完整顶体(live intact acrosome)及其他分类比例在各组间无显著差异(P>0.05)，表明NAM与胆固醇未影响顶体状态。

3.6. Oxidative stress evaluation（氧化应激评价/TBARS）

硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)所测丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平各组间无显著差异(P>0.05)，说明添加物未显著改变冻后脂质过氧化程度。

3.7. In vitro embryo production（体外胚胎生产）

卵母细胞体外成熟扩张率组间无差异。体外受精后卵裂率(cleavage rate)：NAM30组、NAM60组及NAM30+CHOL组显著高于对照组(P<0.05)，单纯CHOL组与对照组无差异。提示特定浓度NAM单独或联用胆固醇可提高早期胚胎发育能力。

四、讨论与结论总结

讨论指出，NAM与胆固醇在本实验冷冻协议下未改善常规精子质量参数（活力、膜完整性、顶体、DNA、MDA），可能与冻融损伤过于剧烈及NAM浓度较低有关，不同于冷藏(refrigeration)研究中NAM或NMN(β-nicotinamide mononucleotide)的正面效果。但NAM 30 μM、60 μM及NAM30+CHOL提升了IVF后的卵裂率，暗示NAM可能通过维持某种尚未被常规检测捕捉的精子功能（如精卵结合能力或相关生化信号）促进早期胚胎发育。

结论(Conclusions)：在绵羊精液冷冻稀释液中添加30 μM和60 μM烟酰胺(nicotinamide, NAM)，单独或与2 mg胆固醇联用，未引起解冻后所测常规精子质量参数的显著变化；但30 μM NAM、60 μM NAM以及30 μM NAM联合2 mg胆固醇的处理获得了较高的胚胎卵裂率(cleavage rates)。