源于苋菜(Amaranthus tricolor)的硫酸化纤维素纳米球：一种具备潜在治疗特性的生物相容性纳米载体

《Results in Chemistry》：Sulfated cellulose nanospheres from Amaranthus tricolor: a biocompatible nanocarrier exhibiting potential therapeutic properties

　　

摘要：研究人员通过硫酸水解法从苋菜(Amaranthus tricolor)生物质中合成了硫酸官能化纤维素纳米球(sulfate-functionalized cellulose nanospheres, A-CNS)。所合成纳米球呈球形形貌，平均粒径为23.11 ± 4.2 nm，结晶度指数(crystallinity index)为80.61%。通过元素分析、能量色散X射线分析(EDAX)及傅里叶变换红外光谱(FT-IR)在特征硫酸相关振动峰处确认了纤维素表面硫酸半酯官能化。合成纤维素纳米球对所试病原菌表现出广谱抗菌活性，可通过活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成及膜损伤抑制生物膜形成及群体感应(quorum sensing, QS)活性。此外，该纳米球具强抗氧化活性及显著自由基清除潜力。生物相容性分析显示其溶血率低于1.4%，具优异血液相容性(hemocompatibility)。该纤维素纳米球对胰腺及肝癌细胞系具显著抗癌活性，而对正常成纤维细胞无明显细胞毒性，洋葱根尖试验亦显示极小遗传毒性(genotoxic effects)。上述多功能特性表明，源于Amaranthus tricolor的硫酸官能化纤维素纳米球有望作为可持续生物相容性纳米材料，应用于生物医学及纳米医药领域。

本文解读基于发表于《Results in Chemistry》的研究论文"Sulfated cellulose nanospheres from Amaranthus tricolor: a biocompatible nanocarrier exhibiting potential therapeutic properties"，由H. Nagaraja等人完成。

【研究背景】全球抗生素耐药性日益严峻，亟需开发源自可再生资源的新型可持续抗菌材料。木质纤维素生物质是制备纤维素纳米晶(cellulose nanocrystals, CNCs)的丰富可生物降解平台，常规CNC呈棒状且本身无固有抗菌性，经硫酸水解引入硫酸酯(–OSO₃^?)基团可赋予静电稳定性及一定生物活性，但传统木材源CNC形态单一、功能有限。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药肠球菌(VRE)及多重耐药(multidrug-resistant, MDR)革兰氏阴性菌仍是重大临床挑战。鉴于此，研究人员以富含生物质的苋菜(Amaranthus tricolor)为绿色原料，通过硫酸水解一步法制备硫酸官能化纤维素纳米球(sulfate-functionalized cellulose nanospheres, A-CNS)，系统评价其理化特征、抗菌/抗氧化/抗癌生物活性及生物相容性，探索植物源纳米纤维素在生物医学中的应用潜力。

【主要关键技术方法】研究人员采集并鉴定Amaranthus tricolor植株，经碱处理(30% NaOH)、漂白(4% NaOCl)及72% H₂SO₄水解(60°C)提取A-CNS；采用X射线衍射(XRD)、透射电子显微镜(TEM)联用能谱(EDS)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)及Zeta电位表征理化性质；通过纸片扩散法评估对Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus和Enterococcus faecalis的抗菌活性；结晶紫染色法测抗生物膜活性；检测铜绿假单胞菌绿脓菌素(pyocyanin, PCN)、绿脓菌素(pyoverdine, PVD)及金黄色葡萄球菌葡萄球菌黄素(staphyloxanthin, STX)以评价抗群体感应(quorum sensing, QS)活性；DCFH-DA探针检测细菌胞内ROS生成；DPPH与ABTS法测抗氧化活性；MTT法检测对人胰腺癌PANC-1、肝癌HepG2细胞系及小鼠正常成纤维L929细胞系的剂量—响应细胞毒性；Allium cepa(洋葱)根尖试验评估有丝分裂指数(mitotic index, MI)及染色体畸变以检测遗传毒性；人红细胞溶血实验评估血液相容性(hemocompatibility)。

【研究结果】

3.1. Sulfate functional sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS extracted from Amaranthus tricolor：研究人员通过碱处理—漂白—硫酸水解从Amaranthus tricolor中获得产率约12%—13.33%的A-CNS，硫酸基主要取代于脱水葡萄糖单元C6位羟基及部分C2/C3位，引入的负电荷使ζ电位达约?21.58 mV至?28 mV，提升水分散性与胶体稳定性，保留纤维素Ⅰ型结晶骨架。

3.2. X-ray diffraction analysis：XRD在2θ=15.8°、22.11°、34.71°出现纤维素Ⅰ型特征峰(110)、(200)、(004)晶面，A-CNS结晶度指数(crystallinity index)为80.61%；谢乐(Scherrer)方程依据(200)晶面估算微晶尺寸约3.23 nm，表明硫酸化轻微降低结晶度但未破坏纤维素Ⅰ型结构。

3.3. Structural and elemental attributes of sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS (TEM–EDS analysis)：TEM显示A-CNS为球形而非棒状CNC形貌，ImageJ统计粒径分布平均23.11 ± 4.2 nm；高分辨TEM见晶格条纹面间距0.219 nm对应(200)面，选区电子衍射(SAED)呈多晶环；EDS检测表面硫含量2.78 wt%，CHNS整体硫含量1.095 wt%，经公式计算表面取代度(degree of substitution, DS)约0.15，体相DS约0.056，处于适宜生物医学范围。

3.3.1. Quantitative confirmation of sulfate Ester functionalization in sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS：FT-IR于1250 cm^?1(S=O不对称伸缩)、1050 cm^?1及850 cm^?1(C–O–S对称伸缩及变形)出现硫酸酯特征吸收，保留纤维素骨架O–H、C–O–C吸收，证实硫酸半酯共价接入。

3.4. UV–vis spectral insights into A-CNS：UV–Vis于~215 nm见含氧基团及硫酸基特征吸收，Tauc作图估算光学带隙约4.86 eV，证实材料可见光区透明、具紫外屏蔽潜力。

3.5. Probing the functional chemistry of sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS through FT-IR：对比原料与产物FT-IR谱，A-CNS新现1250 cm^?1、1050 cm^?1硫酸酯键吸收峰而原料无，确认硫酸官能化且纤维素主链完整。

3.6. XPS analysis of surface elemental composition and chemical states：XPS全谱仅检出C、O、S，表面原子比C 69.68%、O 30.11%、S 0.2%；C 1s分峰见C–C/C–H(284.4 eV)、C–O(286.5 eV)、C=O(287.41 eV)及O–C–SO₃(289.0 eV)；S 2p_3/2位于168.99 eV确认存在硫酸酯(–OSO₃^?)基团，排除物理吸附硫污染。

3.7. Zeta potential analysis：0.05% w/v A-CNS悬浮液于PBS(pH 7.4)中ζ电位均值?21.58 mV(范围?14.08至?32.92 mV)，表明硫酸酯引入负电荷赋予适度胶体稳定性，利于生物界面相互作用。

3.8. Sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS exhibits superior and dose-responsive antibacterial activity：纸片扩散法示A-CNS对E. coli、P. aeruginosa、S. aureus及E. faecalis具浓度依赖性抑菌圈(500 μg/mL时最大约10.6 mm)，明显优于未改性CNC(几乎无活性)；具广谱革兰氏阳/阴性菌杀灭能力。

3.9. Sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS inhibits biofilm formation：结晶紫法测得A-CNS浓度依赖抑制四种菌生物膜形成，革兰氏阳性菌IC₅₀≈100 μg/mL、革兰氏阴性≈150 μg/mL，最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)=50 μg/mL；CNC无抗生物膜活性，证实硫酸基关键。

3.10. Effective anti-quorum sensing(QS) activity of sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS：A-CNS剂量依赖抑制P. aeruginosa绿脓菌素(67.79%)、绿脓菌素(pyoverdine, PVD)(71.45%)及S. aureus葡萄球菌黄素(staphyloxanthin, STX)(69.46%)，IC₅₀≈200 μg/mL；阴离子硫酸基被认为通过结合自诱导(autoinducer, AHL/AIP)分子、螯合二价阳离子及干扰QS受体下调毒力因子表达。

3.11. Mechanistic studies: ROS generation and membrane damage confirmation：DCFH-DA示A-CNS诱导胞内ROS呈剂量升高(500 μg/mL达H₂O₂对照60%)；Bradford蛋白泄漏及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放实验证实膜完整性破坏与胞质内容物外漏，机制为硫酸基促进类芬顿(Fenton-like)反应产ROS致脂质过氧化及细菌细胞膜损伤。

3.12. Antioxidant efficacious sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS：DPPH与ABTS自由基清除率随浓度升高(500 μg/mL分别达82.45%与85%)，IC₅₀分别为40 μg/mL与35 μg/mL，显著强于未改性CNC，归因于表面–OH及硫酸酯增强电子转移与氢供体能力。

3.13. Sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS: a potential anti-cancer agent：MTT结果显示A-CNS对PANC-1(IC₅₀=195.42 μg/mL)与HepG2(IC₅₀=208.8 μg/mL)具浓度依赖抗增殖作用，对正常L929成纤维细胞IC₅₀=589.17 μg/mL，选择性指数(selectivity index, SI)分别为3.01与2.82，提示对癌细胞选择性杀伤，可能通过ROS介导凋亡途径实现。

3.14. Sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS: antimitotic activity：Allium cepa根尖试验中A-CNS各浓度下有丝分裂指数与染色体畸变率近阴性对照水平，无显著纺锤体毒性或致突变性，区别于甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)阳性对照明显抑制分裂，佐证低遗传毒性。

3.15. Sulfate-functionalized cellulose nanospheres A-CNS: Hemocompatible to human RBCs：人红细胞与A-CNS孵育后溶血率最高浓度(1000 μg/mL)仅1.358%，远低于2%血液相容性阈值，证实优良血液相容性(hemocompatibility)。

【讨论与结论】研究表明，以Amaranthus tricolor生物质经绿色硫酸水解可制得球形硫酸官能化纤维素纳米球(A-CNS)，平均粒径23.11 nm、结晶度80.61%、表面ζ电位?21.58 mV、硫酸酯取代度DS≈0.056(体相)—0.15(表面)。A-CNS通过硫酸基促ROS生成及细菌膜损伤机制，对革兰氏阳/阴性病原菌具广谱抑菌、抗生物膜及抗群体感应活性；具良好DPPH/ABTS自由基清除抗氧化能力；对人胰腺PANC-1及肝癌HepG2细胞具选择性抗增殖作用(SI>2.8)，对正常L929细胞低毒、对洋葱根尖无遗传毒性、对人红细胞溶血率<1.4%，综合显示优良生物相容性。本研究首次报道以Amaranthus tricolor植物源合成硫酸化纤维素纳米球并系统验证其多重生物医学功能，拓展了植物源纳米纤维素在抗菌涂层、伤口敷料、药物递送及靶向抗癌纳米制剂中的应用前景。