综述：Duocarmycins作为强效抗癌骨架：化学、构效关系、生物活性、前药设计及抗体偶联药物开发进展

《Results in Chemistry》：Duocarmycins as potent anticancer scaffolds: A8dvances in chemistry, structure–activity relationships, biological activity, prodrug design, and antibody-drug conjugate development

　　

摘要：Duocarmycins是一类首先从链霉菌属中分离得到的强效DNA小沟烷基化剂，可在皮摩尔浓度下发挥细胞毒作用。其作用机制是通过活化的环丙烷亲电体在DNA富含AT的区域进行序列选择性烷基化。尽管Duocarmycins潜力卓越，但临床广泛应用仍难以实现，主要归因于剂量限制性全身毒性及有限的肿瘤选择性。然而，多种前药及抗体偶联药物的开发显著拓展了该类药物的治疗前景。本综述系统总结了1978年至2023年间报道的Duocarmycin类类似物的化学与药理学演进。研究人员检索了PubMed、Scopus、Web of Science、Google Scholar等数据库，以“Duocarmycin”“CC-1065”“DNA烷基化剂”“前药”“抗体偶联药物”“构效关系(SAR)”等为关键词整合文献与专利数据，筛选并批判性评估了聚焦于合成类似物、机制解析、生物活性评价及临床进展的同行评议论文与专利。讨论的核心是对主要烷基化药效团（包括环丙并吡咯并吲哚(CPI)、环丙并苯并[e]吲哚(CBI)、环丙并吲哚(CI)、环丙并吡啶并吲哚(CPyI)及环丙并吡唑并吲哚(CPzI)类似物）的详细构效关系分析，阐明了结构修饰对DNA烷基化效率、细胞毒性及序列选择性的影响。综述进一步讨论了双功能烷基化剂及融合偏端霉素、博来霉素、聚酰胺、吡咯并苯二氮?(PBD)基序的杂合衍生物，以提升序列特异性与DNA识别能力。此外，还全面探讨了酚类前药、生物还原前药以及抗体导向递送系统等近期进展，这些策略旨在降低全身毒性并改善肿瘤选择性。总体而言，相关研究为Duocarmycin类抗癌剂的临床潜力、局限及未来开发提供了宝贵洞见。

引言部分首先明确了Duocarmycins的来源与基本特性，该类化合物是20世纪70年代末从链霉菌属不同菌株培养物中分离得到的一类抗生素，其中CC-1065与Duocarmycin SA为母体成员。其抗肿瘤特性源于能够以不可逆方式选择性烷基化DNA小沟中富含AT区域的腺嘌呤N3位点，通过结合后借助环丙烷亲电中心与DNA形成共价加合物，破坏核酸结构并最终诱导肿瘤细胞死亡。体外实验显示其对HeLa S3细胞具有抑制作用，且在小鼠模型中表现出广谱抗肿瘤效应，细胞毒性可达皮摩尔级别，同时具备规避多药耐药的天然属性。但早期研究发现，其对人类实体瘤活性不佳，且天然化合物会诱发延迟性死亡伴随致死性肝毒性与骨髓毒性，导致临床转化受阻。包括Bizelesin、Adozelesin、KW-2189、Carzelesin在内的多个Duocarmycin衍生物在临床初期阶段均因严重不良反应终止试验。尽管存在临床障碍，Duocarmycins独特的机制、广谱活性及极高效力推动了数十年的持续研究。大量构效关系研究明确了负责DNA烷基化的药效团，通过结构修饰的合成类似物深入解析了序列选择性烷基化、反应活性调控规律，为优化生物活性谱与治疗指数提供了支撑。同时，前药与抗体偶联策略成为提升肿瘤选择性的核心方向，酶触发、pH响应、缺氧激活等前药机制可在肿瘤微环境中控制释放，抗体偶联药物则通过抗原靶向递送细胞毒性载荷，在降低脱靶毒性的同时提升疗效。Duocarmycins凭借极高效力与明确机制成为理想的靶向递送载荷。但目前尚无该类药物获批上市，核心挑战已从提升细胞毒性转向实现高反应性分子的可控、肿瘤选择性递送，本综述整合经典构效关系研究与现代化靶向策略，探索推动其临床转化的设计原则。

天然产物与DNA烷基化机制部分梳理了Duocarmycins的发现历程，1988年从日本富士山麓土壤分离的Streptomyces DO-88中得到Duocarmycin A，随后在同区域分离的菌株中陆续获得B1、B2、C1、C2、D1、D2等类似物，1990年在京都六角堂附近土壤中发现的Streptomyces DO-113则分离得到效力最强的天然成员Duocarmycin SA。这些发现证实了土壤微生物作为结构独特、生理活性显著的天然产物来源的价值，也体现了基于生物多样性的药物发现潜力。Duocarmycins属于极高效力的DNA烷基化剂，对广谱癌细胞系在亚纳摩尔浓度下即可产生致死效应，分离流程涵盖土壤采样、发酵条件优化、次级代谢产物提取、色谱纯化、质谱与核磁共振结构解析及活性评价。其烷基化过程具有高度序列选择性，核心在于活性环丙烷环的结构特征。分子可嵌入DNA小沟，通过三维结构匹配精准定位，确保与DNA螺旋的正确取向以实现序列识别。结合后优先烷基化AT富集区的腺嘌呤N3位点，因AT碱基对仅由两个氢键连接，局部稳定性低于GC区，更易被攻击。烷基化可引发内切酶活性，导致染色质凝聚、基因组DNA断裂并最终凋亡。反应由腺嘌呤N3对环丙烷位阻最小碳的亲核进攻驱动，形成稳定的共价加合物，造成碱基配对破坏、DNA弯曲及局部解旋，干扰复制与转录过程。序列偏好表现为对5'-AAA基序亲和力最强，其次为5'-TTA、5'-TAA、5'-ATA，邻近核苷酸的电子与空间性质会影响靶腺嘌呤的可及性与反应活性。由于目前未发现可有效逆转或清除该加合物的细胞酶途径，Duocarmycins诱导的DNA烷基化被视为近乎不可逆，这是其高效性的核心基础。

构效关系研究部分围绕(+)-CC-1065与Duocarmycins的烷基化药效团展开，明确其活性受烷基化单元反应活性的电子调控、DNA小沟识别的构象需求及靶标诱导活化能力的共同支配，与传统烷基化剂不同，其效力与反应活性呈抛物线关系，即过度稳定会导致烷基化效率不足，过度活泼则会在到达DNA前发生溶剂解，仅在合适的乙烯基酰胺稳定窗口内达到最大细胞毒性。乙烯基酰胺系统作为“反应活性开关”，通过立体电子效应调控环丙烷亲电性，N²位修饰对共轭体系扰动最显著，吸电子基团可通过降低共轭框架电子密度提升稳定性，但过度稳定会落入抛物线下降支。不同烷基化单元（DSA > CBI > CPI > CBQ > CI）在相同DNA识别基序下烷基化位点一致，但反应活性差异显著，证明单元修饰主要影响共价键形成效率而非序列选择性。C7位取代基虽对固有反应活性影响有限，但可通过延伸分子框架、促进DNA结合诱导的构象扭曲提升烷基化效率，体现空间与构象效应的主导作用。DNA结合域通过形状选择性匹配AT富集小沟，天然S-对映体的烷基化效力比R-对映体高100至1000倍，手性匹配决定其在结合位点的立体化学对齐。连接子作为药效团各模块间的电子传递与构象转换桥梁，移除后即使存在环丙烷框架也会丧失烷基化能力。开环(seco)-Duocarmycin类似物中的酚羟基可引发分子内螺环化生成活性环丙烷烷基化剂，掩蔽酚羟基可抑制螺环化从而阻断活性，该机制为前药设计提供了基础，且部分非手性开环类似物可保留同等反应活性。硫代类似物（如MeCTI、isoMeCTI）通过微调电子与空间参数，在不丧失反应活性的前提下缓解环张力，将活性平衡至抛物线最优区间。整体而言，Duocarmycin类似物的优化需要协同调控药效团反应活性、构象活化、DNA识别、立体电子对齐及分子稳定性，而非单一最大化某参数。

针对不同烷基化药效团的细分研究显示，环丙并吲哚(CI)作为紧凑结构，其开环类似物可通过螺环化前体发挥DNA烷基化作用，酚羟基并非烷基化必需但完全去除会导致活性丧失，取代基给电子能力与其细胞毒性和烷基化能力正相关。氨基-seco-CI衍生物在缺氧条件下可被激活，虽整体效力低于seco-CI，但仍可特异性结合腺嘌呤N3。非手性seco-CI衍生物通过引入吲哚、吡咯、苯并咪唑组分形成螺[2,5]环丙烷环己二烯酮，烷基化模式与CC-1065一致，在NCI-60筛选中展现低微摩尔级活性。吲哚C5-O取代的开环环丙吲哚(seco-CI)系列活性与阿霉素相当。ICT2740作为ICT2700经CYP1A1代谢的产物，通过螺环化生成活性环丙烷，在CYP1A1表达的细胞中实现选择性杀伤。聚乙二醇(PEG)修饰的Duocarmycin SA类似物水溶性随修饰程度提升，但DNA烷基化与生长抑制活性呈梯度下降，cLogP与log IC₅₀、log AE（无细胞DNA烷基化效率）呈线性相关，覆盖2.5至0.49的cLogP跨度对应11.2至6.4的log IC₅₀范围，IC₅₀值相差达10⁵倍。

环丙并苯并[e]吲哚(CBI)相比天然产物更易合成、化学稳定性更高且保留强生物活性。C3卤代通过降低乙烯基酰胺共轭提升溶剂解速率，但细胞毒性反而低于未取代母体；C5甲基酯取代会降低烷基化速率；C7位甲氧基或氰基取代可通过延伸烷基化单元长度、增强DNA结合诱导的扭转，加速烷基化进程。DNA结合域的C5'位取代基柔性、形状与尺寸显著影响活性，而C7'位取代影响微弱。三环杂芳基结合域的烷基化效率与细胞毒性高于双环与单环，且不改变序列选择性。N-芳基与N-烯基取代CBI呈现明确构效规律，吸电子基团提升溶剂解速率与生物活性，给电子基团则相反；以烯烃替代酰胺连接子会使毒性降低近1000倍，且天然与 unnatural 对映体均遵循该抛物线稳定性-毒性关系。氨基-seco-CBI-TMI的效力与酚羟基类似物相当，其中4'-甲氧基肉桂酰衍生物活性最强。延长DNA结合域的CBI类似物可模拟(+)-CC-1065效应，部分化合物在NCI-60筛选与小鼠体内模型中表现优异，可延长L1210荷瘤小鼠寿命107%且骨髓抑制低，但C5-COCH₃甲基的存在会引发类似CC-1065的延迟致死效应，去除该甲基的类似物无此毒性。非手性seco-CBI单元衍生物的效力与活性优于CI对应物，含良好离去基团（如氯）的化合物对L1210细胞的毒性比差离去基团高100倍以上，其中AS-I-145可口服或静脉给药，对多种皮下移植瘤有效。非手性seco-羟基-氮杂-CBI-TMI类似物可选择性结合AT富集区并共价修饰腺嘌呤N3，对鼠源与人类癌细胞呈纳摩尔级致死活性，且对多种疟原虫、锥虫、利什曼原虫寄生虫也具有生长抑制活性。

环丙并吡咯并吲哚(CPI)缺乏Duocarmycin SA的C6甲氧羰基与CC-1065的C7甲基，稳定性与CC-1065相当，反应活性是(+)-Duocarmycin SA的6倍，DNA烷基化序列选择与天然产物一致。C6酯基可通过延伸共轭提升烷基化速率与效率，而C7甲基因空间位阻降低效率。C7位羟甲基、甲基、卤素取代可维持高抗增殖活性，酯基或酰胺取代则活性下降；氯代与溴代甲氧基肉桂酰类似物在展现强效抗肿瘤的同时，骨髓与外周血毒性较低且无延迟死亡。丙烯酰吲哚衍生物对小鼠肉瘤180也有显著活性。Duocarmycin SA的C5'位取代通常仅带来轻微活性变化，仅C5'甲氧基与氰基例外，其增效机制无法单纯用电子效应、杂化状态或氢键属性解释，推测与天然产物本身已具备优化的烷基化单元长度有关。

环丙并吡啶并吲哚(CPyI)含8-酮喹啉结构，可通过与金属阳离子络合调控活化程度，Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺的稳定常数依次降低，加入合适路易斯酸可实现选择性烷基化，其反应活性高于DSA与CBI，固有稳定性与CC-1065相当。反向CPyI类似物在无金属催化时烷基化速率极低，加入Zn²⁺后可恢复至天然产物水平。环丙并吡唑并吲哚(CPzI)同样符合溶剂解能力、吸电子性与细胞毒性潜力的线性关联，N-Boc保护类似物体外活性中等，两个与Adozelesin结构相似的 chiral 类似物呈皮摩尔级效力，其中特定异构体对小鼠L1210细胞活性显著。

前药开发部分针对Duocarmycins的系统毒性问题，分为酚类前药、生物还原前药、基因导向酶前药(GDEPT)与抗体导向酶前药(ADEPT)四大策略。酚类前药通过保护活性酚羟基阻止螺环化，包括乙烯基醚、氨基甲酸酯、胃泌素受体靶向氨基甲酸酯、人血清白蛋白反应性马来酰亚胺己酸、铁(II)反应性内过氧化物等，酯与氨基甲酸酯前药可在细胞内水解释放活性seco-药物，对L1210细胞呈皮摩尔级毒性。CBI基酯与氨基甲酸酯前药的活化机制类似KW-2189与Carzelesin，二十二碳六烯酸(DHA)酯因易被肿瘤摄取且本身具有抑瘤作用备受关注，酯类总体效力高于胺类，DHA酯与甲基哌嗪氨基甲酸酯活性最高。光活化前药通过紫外不稳定O-连接2-硝基胡椒基掩蔽酚羟基，365 nm光照可高效活化，适用于不可切除或手术残留肿瘤的局部治疗，也可结合近红外光控与抗体靶向构建诊疗一体化系统。葡萄糖醛酸苷前药在血液中稳定性高，可被肿瘤高表达的β-葡萄糖醛酸酶激活，对A549细胞的活性提升约1000倍，尤其适合乳腺癌治疗。Duocarmycin B1的磷酸酯、N-甲基哌嗪、中性糖基前药水溶性优异，其中氨基甲酸酯在体内表现突出，疗效媲美KW-2189且无血液毒性。

生物还原前药利用实体瘤缺氧区域氧化还原酶激活硝基或醌类触发基团，硝基可被一电子还原为胺或羟胺代谢物进而螺环化，醌类则被还原为氢醌后发挥烷基化作用。含磺胺基团的CBI类似物缺氧细胞毒性比(HCR)可达330，与化疗或放疗联用可产生协同效应，磷酸预前药在水中溶解度更佳，在小鼠异种移植模型中安全有效。N-酰基O-氨基酚前药通过弱N-O键被还原切割释放活性药物，环状N-O类似物相比早期线性结构体内稳定性更好，仍可被还原剂快速裂解，其中特定化合物体内效力是游离药物的近3倍。Mitomycin A醌基融合的Duocarmycin在还原态可序列选择性烷基化DNA，对富含DT-黄递酶的H460细胞效力高于缺陷型H596细胞。目前此类缺氧激活前药尚未获批，未来需聚焦提升旁观者效应，并通过生物标志物筛选缺氧富集患者开展临床试验。

GDEPT策略通过载体将酶基因导入肿瘤，表达的酶将前药转化为细胞毒性形式，氧耐受黄素单核苷酸硝基还原酶(NTR)是常用工具，硝基噻吩、硝基咪唑、硝基呋喃、硝基苯等芳香族氨基甲酸酯前药在NTR存在下可显著提升活性，腺病毒介导膜结合β-葡萄糖醛酸酶联合前药治疗小鼠CL1-5异种移植瘤，中位生存期从35天延长至150天以上，9只小鼠中7只完全缓解，验证了非抗体酶递送系统的可行性。ADEPT策略则将抗体-酶偶联物靶向结合肿瘤表面抗原，再给予前药实现原位激活。糖苷类seco-CI-TMI前药在糖苷水解酶存在时对A549细胞活性提升千倍；seco-CBQ半乳糖苷以二级氯替代一级氯降低直接烷基化风险，在β-D-半乳糖苷酶存在时IC₅₀可达0.2 nM，无酶时毒性降低1600至3140倍；氯乙基seco-CBI糖苷的两个非对映体活性差异显著，anti-异构体效力是syn-型的200倍；含N,N-二甲氨基乙氧基吲哚羧酸的糖苷前药在β-半乳糖苷酶作用下活性提升5000倍，(+)-对映体效力是(-)-型的1000倍。综合比较显示，酶裂解型酚类前药（含糖苷）与ADEPT系统在选择性、活化效率、系统稳定性与体内效力上平衡最佳，缺氧激活与GDEPT设计虽生物学特异性优异，但在临床转化与异质性肿瘤旁观者效应上仍面临挑战。

双功能烷基化剂部分利用Duocarmycins的手性结合特性，天然(+)-对映体沿3'→5'方向结合并烷基化5'-AAAA序列，非天然(-)-对映体则沿5'→3'方向结合并烷基化相同序列，天然对映体对L1210细胞的效力是非天然的10倍。外消旋seco-CBI二聚体中，N3-N3连接最长效，C7-N3二聚体活性次之，C7-C7最弱，连接链长度同时影响效力与肿瘤选择性。刚性连接子的CPI双烷基化剂中，3,3'-(1,4-亚苯基)二丙烯酰衍生物体内治疗比(TGI50/MTD)达30.7，优于Bizelesin；含一个或两个芳香环的3,3'-亚芳基双丙烯酰连接CBI类似物对HeLa S3的IC₅₀可达2.74 pM，对Colon 26腺癌的TGI在1.95 mg/kg剂量下达89%，对人结肠癌CX-1模型在7.81 mg/kg下TGI为83%。

杂合衍生物通过融合不同DNA结合模块拓展功能，将CPzI烷基化药效团与偏端霉素A型聚吡咯连接得到水溶性杂合体，苄基R¹取代因空间位阻无法烷基化，甲基R²系列可高效烷基化AT区，效力超过单一CPzI单元。CBI与博来霉素A2的融合杂合体虽细胞毒性下降，但博来霉素域可作为嵌入剂而不改变序列选择性。CPI-lexitropsin杂合体结合模式偏向AT富集区，还可烷基化鸟嘌呤，反式烯连接子可提升活性，特定化合物平均IC₅₀为5.62 nM，优于直接连接的CPI单元。CBI与lexitropsin夹心杂合体预测结合力更强，且适合固相合成构建库。seco-CBI与吡咯聚酰胺共轭物可同时结合双链DNA的GC碱基对，乙烯基连接子对烷基化至关重要，可抑制基因转录，天然(12S)-CBI对映体效力显著高于非天然型，异构体还会影响腺嘌呤烷基化的位点与链选择性。lexitropsin-seco-CI杂合体中非天然R-对映体DNA切割效力高于S-对映体，苯并呋喃与吡咯/咪唑二酰胺融合的非手性CI杂合体可通过选择咪唑或吡咯精准靶向特定序列旁的腺嘌呤N3。Duocarmycin A亚基与咪唑-吡咯聚酰胺杂合体在Distamycin存在时可改变烷基化位点至鸟嘌呤N3，合成聚酰胺可替代Distamycin实现靶向，特定双烷基化剂可选择性交联九碱基对序列，为基因调控工具开发提供可能。吡咯并苯二氮?(PBD)与CI、CBI融合的杂合体可同时烷基化腺嘌呤并与鸟嘌呤形成交联，UTA-6026可交联跨越六个碱基对的DNA，氨基-CBI-PBD可特异性作用于AT富集区腺嘌呤N3，在低浓度下优先形成链间交联。

抗体偶联药物(ADCs)部分详述了Duocarmycin作为载荷的应用进展，分为两类设计：A型直接将seco-Duocarmycin酚羟基通过连接子与抗体相连，依赖溶酶体蛋白酶裂解二肽（如缬氨酸-瓜氨酸）、可还原二硫键或磷酸酯释放酚羟基，常结合自毁间隔子实现级联释放；B型将酚类前药通过外周位点与抗体连接，增加一层前药选择性。目前已报道超过15种Duocarmycin基ADCs，靶向HER2的SYD985已进入III期临床，靶向CD70的BMS-936561因安全性与疗效问题终止I期，其余多处于临床前阶段。对比其他临床常用ADC载荷，Duocarmycins通过序列选择性DNA小沟烷基化发挥作用，优势在于极高效力、对增殖与非增殖细胞均有效、具备旁观者效应潜力，局限为治疗窗窄、脱靶DNA损伤风险及合成复杂度高。未来需协同优化载荷选择、抗体靶向性、连接子设计与结合效率，以推动其临床转化。

临床毒理与安全部分回顾了已进入临床评估的Duocarmycin衍生物，CC-1065体外效力是阿霉素的400倍，但单次或多剂给药后会在数天延迟期导致正常小鼠与兔致死，限制其开发。Adozelesin无延迟致死，对白血病、黑色素瘤、肉瘤、结肠癌、胰腺癌小鼠模型及人肿瘤异种移植瘤均有效，与顺铂联用具协同效应，对卵巢癌细胞LD₉₀达0.048 nM，可诱导G2-M期阻滞与多倍体，但停药后肿瘤易复发。Carzelesin需经苯基尿烷水解与环化两步激活，效力略低于Adozelesin但仍比传统化疗药高100至1000倍，体内对结肠癌与横纹肌肉瘤有效，且停药后复发少于Adozelesin。Bizelesin为双功能CPI二聚体，对白血病、黑色素瘤、肾癌、肠癌、肺癌模型有效，8/10 L1210荷瘤小鼠28天无瘤，但药理剂量下DNA损伤轻微，高浓度才出现链间交联。KW-2189作为Duocarmycin B2水溶性前药，需羧基酯酶激活为DU-86，对小鼠结肠癌、黑色素瘤、白血病及多人源移植瘤有效，无CC-1065样延迟毒性，细胞内羧基酯酶水平与敏感性正相关。Yatakemycin效力是丝裂霉素C的1000倍，其DNA损伤可通过核苷酸切除修复途径被AlkD与YtkR2修复，但修复效率受限于Yatakemycin-DNA复合物稳定性。总体而言，多个进入临床的衍生物均因剂量依赖性毒性（尤其是骨髓抑制）与疗效不足未能获批，凸显了靶向递送策略的必要性。

未来展望指出，Duocarmycins凭借独特的序列选择性DNA烷基化机制，可精准杀伤肿瘤细胞并减少正常组织损伤，有望克服传统化疗的广谱毒性与耐药性问题，对难治性与耐药性肿瘤尤其具潜力。后续研究需聚焦于靶向递送系统优化、联合治疗