取代苄叉基吡唑基序的合成、表征、体外抗菌效力和细胞毒性

《Results in Chemistry》：Synthesis, characterization, in vitro antimicrobial efficacy and cytotoxicity of substituted benzylidene-based pyrazole motifs

　　

鉴于微生物对现有药物的耐药性不断出现且持续存在，发现新型抗菌剂的需求仍然迫切。本研究调查了一系列苄叉基吡唑（benzylidene-based pyrazoles, BBP，3a–i）作为潜在抗菌剂的合成、表征和生物学评价。前体苄叉基丙二腈（benzylidene-based malononitriles, 2a–i）通过将丙二腈与取代芳香醛缩合合成，随后与水合肼反应生成目标BBP化合物（3a-i），产率各异。结构表征采用紫外-可见光谱（UV–Vis）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、¹H核磁共振（NMR）、¹³C NMR和DEPT-135光谱。波数约3500–3200 cm^?1（胺NH）、3145–3034 cm^?1（芳香CH）、2998–2814 cm^?1（脂肪族CH）、1659–1595 cm^?1（C=C）和1576–1528 cm^?1（C=N）的振动频率证实了合成，而δ_H 11.67–11.91（2H单峰，2(C=NH)）和δ_H 4.09–4.35（2H单峰，2(NH)）的单峰进一步支持了化合物（3a-i）的形成。体外抗菌实验显示，化合物3b对金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus* 25923）、化脓链球菌（*Streptococcus pyogenes*）、粪肠球菌（*Enterococcus faecalis*）、鼠伤寒沙门菌（*Salmonella typhimurium*）和志贺菌属（*Shigella* sp.）表现出最强的抗菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为3.13 μg/mL。该化合物还对白色念珠菌（*Candida albicans*）和烟曲霉（*Aspergillus fumigatus*）展现出潜在抗真菌活性（MIC = 3.13 μg/mL）。细胞毒性筛选确认所有化合物均具有低毒性。计算机模拟对接显示有利的结合亲和力（?6.599至?5.692 kcal/mol）、结合自由能（?32.56至?22.3 kcal/mol）及良好的ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）特性。分子动力学模拟证实了结构稳定性，其中3b的表现与参考配体629相当。总体而言，化合物3b（4-(2-氯苯亚甲基)吡唑烷-3,5-二亚胺）被确定为有前景的抗菌候选药物。

以下是对论文《取代苄叉基吡唑基序的合成、表征、体外抗菌效力和细胞毒性》的解读：

**研究背景与目的**

杂环化合物，尤其是含氮杂环，是众多上市药物的核心结构单元。吡唑作为五元芳香杂环（1,2-二唑），因独特的电子和氢键特性，能有效与生物大分子相互作用，在药物设计中地位重要。然而，微生物对现有抗菌药物的耐药性持续加剧，成为全球健康挑战，导致感染性疾病发病率和死亡率上升。例如，金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）、大肠杆菌（*Escherichia coli*）等病原体引发的感染日益难治，且常用抗生素如环丙沙星伴随皮肤刺激、胃肠道不适等副作用。因此，亟需开发具有新作用机制、低毒性的新型化学实体（NCEs）。本研究旨在设计并合成一系列苄叉基吡唑衍生物，通过体外实验和计算机模拟评估其抗菌潜力，为克服耐药性提供候选分子。

**研究内容与结论**

研究人员成功合成并表征了九种苄叉基吡唑化合物（3a–i），重点评估了其抗菌活性。实验表明，化合物3b（4-(2-氯苯亚甲基)吡唑烷-3,5-二亚胺）表现最优：对多种细菌和真菌的最低抑菌浓度（MIC）低至3.13 μg/mL，与临床药物环丙沙星和氟康唑相当或更优，且对结核分枝杆菌复合群（MTBC）敏感和耐药菌株均具活性。所有合成化合物细胞毒性低，安全性良好。计算机模拟包括分子对接、MM-GBSA结合自由能计算、ADMET预测及分子动力学模拟（200 ns），进一步证实化合物3b与靶蛋白（金黄色葡萄球菌酪氨酰-tRNA合成酶，TyrRS）稳定结合，且ADMET特性理想。该研究将化合物3b确立为有前景的抗菌先导化合物。论文发表在《Results in Chemistry》期刊。

**关键技术方法**

研究人员采用了以下主要关键技术方法：1）有机合成方法：通过丙二腈与取代芳香醛在碱性条件下缩合制备苄叉基丙二腈中间体（2a–i），再与水合肼回流缩合得到目标吡唑衍生物（3a–i）。2）结构表征技术：使用紫外-可见光谱（UV–Vis）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）及¹H NMR、¹³C NMR和DEPT-135核磁共振波谱确证结构。3）体外抗菌/抗真菌实验：采用琼脂扩散法和微量稀释法测定抑菌圈直径（ZOI）和MIC，菌株来源于美国模式培养物保藏中心（ATCC）。4）计算机模拟方法：使用Schr?dinger Maestro进行分子对接（Glide XP）、MM-GBSA结合自由能计算、ADMETlab 3.0评估ADMET特性，以及GROMACS 2024进行分子动力学模拟（CHARMM36力场，200 ns）。5）细胞毒性实验：采用MTT法评估化合物对人正常细胞的毒性。

**研究结果**

**3.1 化学合成**
研究人员通过两步反应成功合成九种目标化合物（3a–i），产率59.22%至78.11%。FT-IR和NMR（包括DEPT-135）光谱特征峰（如NH、C=N、C=C等）证实了结构的正确性。例如，化合物3a的¹H NMR显示δ_H 11.90 ppm（C=NH）和δ_H 4.28 ppm（NH）信号。

**3.2 体外抗菌活性**
体外抗菌筛选（1000 μg/mL）表明，所有化合物对测试菌株均有不同程度抑制，其中化合物3b最为突出：对金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、粪肠球菌、鼠伤寒沙门菌的抑菌圈直径（ZOI）为30.50–31.50 mm，与环丙沙星（30.50–31.00 mm）相当；对志贺菌属为27.00 mm。MIC测定结果显示，化合物3b对上述五种细菌的MIC均为3.13 μg/mL，与环丙沙星相同。对铜绿假单胞菌活性较弱（MIC=12.50 μg/mL）。抗真菌实验中，化合物3b对白色念珠菌和烟曲霉的MIC均为3.13 μg/mL，与氟康唑一致。抗结核活性测试中，化合物3b在80、40和20 μg/mL浓度下均对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌（包括多药耐药菌株）表现出完全敏感。

**3.3 细胞毒性研究**
MTT实验显示，在500 μg/mL浓度下，化合物3a–i的细胞毒性为5.60%至22.20%，与利福平对照（6.60%）相比处于低水平，其中化合物3a毒性最低（5.60%）。所有合成化合物毒性远低于阳性对照甲苯（88.90%），表明安全性良好。

**3.4 构效关系（SAR）分析**
化合物3b的优良活性归因于邻位氯原子（吸电子基团）增强了电子缺乏性和亲脂性，同时邻位取代提供了有利的空间构象，有助于与微生物靶点结合。供电子基团（如甲氧基）通常降低抗菌效力。

**3.5 计算机模拟研究**
**3.5.1 分子对接、MM-GBSA和蛋白-配体相互作用**
分子对接显示，化合物3a–i的对接分数为?6.599至?5.652 kcal/mol，虽低于共结晶配体629（?10.678 kcal/mol），但仍显示稳定结合。MM-GBSA结合自由能为?32.56至?22.23 kcal/mol，均为负值，支持稳定复合物形成。关键氢键作用涉及残基ASP40、TYR36和ASP177；化合物3b还形成卤键，化合物3g形成π-阳离子相互作用。

**3.5.2 ADMET和类药性**
ADMET预测表明，所有合成化合物均符合Lipinski五规则（无违反），LogP均小于5，显示良好渗透性和溶解性。Caco-2和MDCK细胞渗透性预测支持吸收潜力。无hERG+抑制预测的心脏毒性风险。合成可及性良好（SA分数3）。整体ADMET特征支持其作为候选药物的前景。

**3.5.3 分子动力学模拟**
200 ns模拟结果显示：化合物3b的RMSD在初始波动后稳定于2.0–2.5 ?，与参考配体629（1.8–2.0 ?）接近；而化合物3g具有更高且波动更大的RMSD（3.3–4.5 ?）。RMSF分析表明3b诱导的残基波动最小。氢键分析显示3b与蛋白维持4–12个氢键，稳定性与参考配体相当。回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）分析显示，配体结合均导致蛋白构象一定程度的扩展，其中3b引起的改变适中。整体上，化合物3b的动态稳定性与参考配体相似，优于3g。

**总结与结论**

本研究通过实验与计算相结合的方法，鉴定出化合物3b（4-(2-氯苯亚甲基)吡唑烷-3,5-二亚胺）为广谱、低毒的潜在抗菌先导化合物。其作用机制可能与抑制细菌酪氨酰-tRNA合成酶（TyrRS）相关。研究结果为开发针对耐药病原体的新型抗菌药物提供了有价值的分子框架。

**结论部分翻译**
成功合成并结构验证了一系列吡唑衍生物（3a–i）。这些化合物对临床相关细菌和真菌菌株表现出广谱抗菌活性。值得注意的是，化合物3b显示出最高效力，其特征为低杀菌和低杀真菌阈值，并对药物敏感和多药耐药的结核分枝杆菌复合群分离株均具强效活性。所有衍生物均显示极低细胞毒性，指示有利的安全谱。计算分析进一步揭示了强结合亲和力、稳定的蛋白-配体相互作用以及可接受的ADMET特性。尽管化合物3g显示出最优对接分数，但化合物3b展现出与参考配体相当的优越动态稳定性。综合而言，这些结果将化合物3b定位为开发针对耐药病原体的新型抗菌药物的有力先导候选物。