通过合成、双重 α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶抑制、多尺度生物学评价及分子动力学研究揭示新型吡唑-三唑杂合体的抗糖尿病潜力

《RSC Advances》：Unlocking the antidiabetic potential of novel pyrazole-triazole hybrids through synthesis, dual α-amylase/α-glucosidase inhibition, multiscale biological evaluation, and molecular dynamics studies

　　

本研究旨在基于吡唑连接的碳酰肼骨架设计高效抗糖尿病候选药物。研究人员合成了18个由取代吡唑-碳酰肼进一步连接吡唑或1,2,3-三唑并吡唑的衍生物。所有合成化合物均接受了针对 α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶的抑制活性评价。其中，化合物、、显示出显著的 α-淀粉酶抑制作用（IC₅₀ = 8.48 ± 0.04–30.54 ± 0.03 μM），并在25 μM浓度下表现出可观的 α-葡萄糖苷酶抑制活性。随后，将有前景的候选化合物、、用于体内研究，采用葡萄糖耐量和四氧嘧啶诱导糖尿病模型进行评估。所筛选化合物在血糖控制方面表现出显著改善，其效力高于标准治疗。化合物表现出最强的抗高血糖效应，在四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠模型中使血糖水平降低38.76%，并在口服葡萄糖耐量试验中维持长达4小时的显著降糖活性。安全性评价包括在正常细胞系Wi-38细胞上的细胞毒性检测及小鼠亚急性毒性研究，结果显示化合物、、在小鼠中未观察到明显毒性，且所有肝、肾及心脏生物标志物均保持在正常范围内。这些化合物有望成为潜在的抗糖尿病药物。此外，分子对接结合分子动力学研究显示，其与关键氨基酸残基具有较强结合亲和力。

该论文发表于《RSC Advances》，围绕2型糖尿病（T2DM，2型糖尿病）餐后高血糖控制这一核心问题，提出并验证了一类新型吡唑杂合分子的抗糖尿病潜力。糖尿病是一种长期代谢性疾病，其特征为持续性高血糖，并可逐步累及眼、血管、心脏、肾脏和神经。T2DM作为最常见类型，主要由胰岛素抵抗及胰岛素分泌缺陷引起。针对该疾病，抑制膳食碳水化合物消化相关酶——α-淀粉酶（α-amylase）与α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）——被认为是控制餐后高血糖的有效策略。前者负责淀粉初始水解，后者催化末端糖苷键断裂并释放葡萄糖，因此双靶点干预能够延缓复杂碳水化合物向葡萄糖的转化。然而，现有药物如阿卡波糖虽可抑制相关酶活性，但由于对α-淀粉酶的非特异性抑制，常引起胃肠道不良反应。因此，寻找兼具适度α-淀粉酶抑制与有效α-葡萄糖苷酶抑制的新型分子，是该研究展开的重要现实依据。

在这一背景下，研究人员基于吡唑（pyrazole）和1,2,3-三唑（1,2,3-triazole）两类已知具有广泛生物活性的杂环药效团，设计了两大系列杂合分子：一类为吡唑-吡唑杂合体，另一类为1,2,3-三唑并吡唑-吡唑杂合体，并通过碳酰肼/腙键（hydrazone linker，腙连接基）将这些结构进行连接。作者的设计逻辑源于多个层面：其一，吡唑骨架存在于已获批抗糖尿病药物中；其二，三唑与吡唑基元此前已被报道具有α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶抑制活性；其三，腙键具有氢键供受体特征及电子离域能力，有利于增强与靶酶活性位点的相互作用；其四，类似酰胺键的连接方式在多种临床抗糖尿病药物中具有结构合理性。基于上述认识，研究构建了兼具多药效团特征的分子架构，并系统评估其体外、体内与计算化学层面的抗糖尿病表现。

研究所采用的关键技术方法主要包括以下几类。首先，在化学合成层面，研究人员通过Claisen缩合、Vilsmeier–Haack反应及后续缩合反应，合成18个目标化合物，并利用红外光谱（IR）、¹H核磁共振（¹H NMR）、¹³C核磁共振（¹³C NMR）和高分辨质谱（HRMS）完成结构确证。其次，在生物学评价层面，采用3,5-二硝基水杨酸（DNSA）法检测α-淀粉酶抑制活性，采用对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷（PNP-G）法评价α-葡萄糖苷酶抑制作用，并在Wi-38正常人肺成纤维细胞中进行MTT细胞毒性检测。再次，体内药效与安全性通过四氧嘧啶诱导糖尿病Sprague Dawley大鼠模型、正常血糖Swiss albino小鼠口服葡萄糖耐量试验（OGTT）及小鼠亚急性毒性实验完成。最后，采用AutoDock Vina分子对接、GROMACS 2021.4分子动力学模拟，以及ADMETlab 3.0和ProTox-II开展药代动力学与毒性预测。动物样本来源于Egyptian Russian University药学院实验动物设施。

在结果部分，论文首先以“2.1. Chemistry”展示了目标化合物的合成路线与结构表征结论。研究人员成功构建了两类腙连接的吡唑杂合物，并通过光谱数据确认了目标结构的形成。IR谱中约3228 cm^?1的N–H伸缩振动、约3059 cm^?1的–CHN伸缩振动以及约1659 cm^?1的羰基吸收峰，共同支持腙连接和酰胺样结构的存在。¹H NMR中，δ 11.81–12.08 ppm的腙NH单峰、δ 9.01–9.28 ppm的亚甲亚胺氢信号以及吡唑环特征氢信号，进一步证明了产物结构与设计一致。部分化合物还观察到以反式构象为主、伴随少量顺式构象的现象。¹³C NMR数据中羰基及取代基特征碳信号同样与目标骨架吻合。

在“2.2.1. α-amylase enzyme inhibition”中，18个化合物均接受了α-淀粉酶抑制活性评价。结果显示，部分化合物活性较弱，IC₅₀大于313.45 μM；部分化合物处于中等活性范围；而若干化合物则表现出显著抑制作用，IC₅₀介于8.48–45.24 μM。其中最突出的化合物为，其IC₅₀达到8.48 μM，优于或接近标准药阿卡波糖，提示其在抑制淀粉水解方面具有较强潜力。

在“2.2.2. SAR study of designed compounds against the α-amylase enzyme”中，研究人员总结了结构–活性关系（SAR，结构-活性关系）。对于吡唑-吡唑系列，未取代苯基取代的化合物活性较差；通过在R₁或R₂位置引入甲氧基或氯原子后，活性有所改善，其中氯取代尤其关键。双氯取代构型表现出更强的α-淀粉酶抑制效果。对于三唑并吡唑系列，该系列整体上优于对应的吡唑-吡唑系列，说明末端三唑并吡唑环能够增强酶结合能力。作者据此指出，末端杂环类型与芳基取代模式是驱动α-淀粉酶抑制活性的关键结构因素。

在“2.2.3. α-glucosidase enzyme inhibition”中，18个化合物以25 μM浓度进行α-葡萄糖苷酶抑制筛选。结果显示，多种化合物的抑制率超过50%，部分达到50.34%–65.18%，而另一些仅表现为中等或较弱活性。结合双酶结果可见，部分候选分子兼具较强α-淀粉酶抑制与可观α-葡萄糖苷酶抑制，符合研究最初提出的双靶点设计目标。

在“2.2.4. Cytotoxicity”中，研究人员选取最有前景的化合物、、开展Wi-38正常细胞毒性测试。三者IC₅₀分别为45.91 ± 1.481、59.99 ± 1.935和68.50 ± 2.21 μM，均高于阳性细胞毒药物staurosporine的21.29 ± 0.68 μM，表明这些化合物对正常细胞的毒性较低，具有较为有利的治疗窗。

在“2.2.5. Antihyperglycemic effects of the test compounds in the alloxan-induced diabetic rat model”中，研究人员基于体外活性筛选出、、进入体内药效评价。在四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠模型中，三者口服给药后均能降低餐后血糖，其中化合物效果最强，在120 min时使血糖较糖尿病对照组下降约38.76%；化合物次之，降幅为29.33%；化合物也表现出一定作用，降幅为18.19%。这些结果优于或至少可比标准药vildagliptin，说明所选化合物具备明确的体内抗高血糖活性。

在“2.2.6. Effect of test compounds on oral glucose tolerance in normoglycemic mice”中，研究进一步通过OGTT评价急性葡萄糖耐量调节作用。首先，食物摄入量在各组间无统计学差异，排除了进食差异对血糖的干扰。随后发现，对照组在进食后1 h血糖迅速升高，而阿卡波糖和测试化合物均能显著减弱这一升高幅度。其中化合物在1 h时将血糖降至114.5 ± 3.67 mg dL^?1，降幅为28.06%，表现最优；化合物和化合物也显示出明显作用。值得注意的是，化合物与化合物的降糖效应可持续4 h，提示其具有较持久的药效学特征。结合糖尿病模型结果，作者认为这些化合物尤其是，在控制餐后高血糖方面具有较强应用前景。

在“2.2.7. Subacute toxicity assessment in mice”中，研究人员对、、进行了100 mg kg^?1单次口服后的48 h亚急性毒性评估。结果显示，小鼠未出现行为异常、痛苦表现或死亡。生化指标方面，丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）均维持在正常范围，提示无明显肝毒性；血清尿素与肌酐未见显著异常，提示肾功能未受损；肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）水平亦与对照组相近，表明未观察到心脏毒性。该结果为候选化合物的进一步药理开发提供了安全性依据。

在“2.3.1. Molecular modelling”中，分子对接针对活性较好的化合物、、与靶酶α-淀粉酶（PDB: 1BAG）和α-葡萄糖苷酶（PDB: 3 A4A）进行了结合模式分析。研究显示，这些分子可与Tyr59、Phe105、Asp269、Gln63、Asp274等关键残基形成π–π堆积、π-阴离子作用、π–σ作用及氢键。特别是化合物，在两种酶的活性位点中均形成多重稳定相互作用，为其实验抑制活性提供了结构基础。

在“2.3.2. Correlation between computational and experimental findings”中，作者指出计算结果与体外实验趋势总体一致。尤其是化合物在分子对接中呈现有利构象，并通过氢键与疏水/π相互作用网络获得稳定结合，从机制上解释了其显著的酶抑制表现。分子动力学模拟进一步验证了该结合状态在显式溶剂条件下的稳定性。

在“2.3.3. Molecular dynamics studies”中，研究以化合物为代表，对其与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶复合物开展250 ns分子动力学模拟。通过均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回转半径（R_g）、溶剂可及表面积（SASA）和氢键数目五类描述符综合分析后发现，化合物结合后，两种酶的骨架波动均降低，局部柔性下降，整体构象更紧凑，溶剂暴露减少，并维持稳定氢键网络。这表明该化合物能稳定酶活性口袋构象，从而支持其双酶抑制机制。尤其在α-淀粉酶中，平均氢键数量更高，说明其与该酶的结合稳定性可能更强，这与体外实验中较优的α-淀粉酶抑制活性相一致。

在“2.3.4. In silico evaluation of pharmacokinetic parameters”中，ADMETlab 3.0预测结果表明，化合物、、具备较好的类药性，分子量、拓扑极性表面积（TPSA）、氢键供体/受体数及log P等参数均处于口服活性药物较理想的范围内，并符合Lipinski五规则，提示具有口服生物利用度潜力。不过，模型预测其较难穿越血脑屏障（BBB），这虽限制了中枢适应证拓展，但对外周降糖靶点而言并非明显缺陷。

在“2.3.5. Toxicity impact”中，ProTox-II预测三种化合物均位于毒性5–6级，估算LD₅₀约为4700–6500 mg kg^?1，急性毒性较低。对肝毒性、致癌性、致突变性、免疫毒性和细胞毒性的预测均不显著，但一致提示存在轻度肾毒性信号。作者据此认为，这些结果总体支持其安全开发潜力，同时也提示后续结构优化应关注肾毒性风险。

论文讨论部分围绕“体外酶抑制—体内降糖—计算模拟支撑”这一完整证据链展开。研究表明，含吡唑与1,2,3-三唑并吡唑双杂环并由腙键连接的分子能够通过多位点结合方式靶向碳水化合物水解酶，并在动物实验中转化为可观的降糖效应。结构–活性关系分析说明芳香环取代尤其是氯取代与末端三唑并吡唑环的引入，有助于提升α-淀粉酶抑制效能；体内结果则进一步确认，强酶抑制候选物能够在糖尿病模型和葡萄糖负荷模型中改善血糖反应。与此同时，细胞毒性、亚急性毒性与计算毒理结果共同显示，该类分子整体安全性较好，但仍需在后续优化中关注潜在肾毒性及进一步药代动力学完善。整篇论文的意义在于，不仅提出了一种新的双靶点抗糖尿病分子设计思路，还通过从化学合成到体内外验证再到分子机制解释的多层级研究，明确了该骨架作为未来抗糖尿病先导结构的开发价值。

研究结论部分可译述如下：本研究设计并合成了两类以碳酰肼连接的吡唑杂合物，分别进一步连接吡唑和1,2,3-三唑并吡唑。基于两类杂环及酰胺样连接在已知抗糖尿病药物中的生物学相关性，研究人员将该杂合骨架用于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶双重抑制评价，并发现多个化合物具有显著的双重抑制潜力。其中，吡唑-吡唑杂合物在抑制α-淀粉酶方面活性增强，IC₅₀为8.48 μM，并在25 μM时对α-葡萄糖苷酶表现出62%的抑制率；对于1,2,3-三唑并吡唑-吡唑杂合物，化合物和化合物表现出较强的α-淀粉酶抑制作用，IC₅₀分别为30.54和14.89 μM，并具有中等α-葡萄糖苷酶抑制活性。在体外结果鼓舞下，研究人员选取、、开展体内评价，分别采用四氧嘧啶诱导糖尿病模型和口服葡萄糖耐量试验考察其降糖潜力。其中化合物表现最为突出，在四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠模型中使血糖下降约38.76%，并在口服葡萄糖耐量试验中维持4 h降糖活性。此外，小鼠亚急性毒性评价显示化合物未引起行为异常、死亡或明显肝、肾、心毒性。分子对接及分子动力学模拟则以化合物为例，从机制层面说明其可在酶活性位点内稳定结合，从而支持实验观察到的抑制活性。总体而言，研究结果突显了这类吡唑基杂合物作为高效双重抑制剂的潜力，并为未来抗糖尿病治疗药物的开发提供了合理的先导骨架。