通过定点修饰mRNA 3′末端增强其稳定性与翻译潜能

《RSC Chemical Biology》：Enhancing mRNA stability and translational potential through tailored modifications at the 3′ end

　　

聚腺苷酸尾（poly(A) tail）通过多种RNA-蛋白质相互作用调控mRNA的周转与翻译，而去腺苷酸化（deadenylation）是胞质主要降解途径的起始步骤。研究人员报道了一种简单的转录后策略，通过酶促连接短链化学修饰的5′-磷酸化二核苷酸来保护合成mRNA的3′末端。利用T4 RNA连接酶1（T4 RNA ligase 1），研究人员将含有2′-O-甲基化（2′-O-methyl）和/或硫代磷酸酯（phosphorothioate）的A-或G-二核苷酸连接到模型寡聚腺苷酸以及携带约150 nt聚腺苷酸尾的水产荧光素酶（Gaussia luciferase, GLuc）mRNA的3′末端。所有连接产物在体外对人源CNOT7介导的去腺苷酸化表现出强抗性，而未修饰的对照mRNA则发生了聚腺苷酸尾移除。在兔网织红细胞裂解液（rabbit reticulocyte lysate, RRL）中，3′-修饰的GLuc mRNA与对照的翻译水平相当，表明对翻译机器的最小干扰。在哺乳动物细胞（A549、JAWSII和HEK293）中，蛋白产出量取决于二核苷酸结构和细胞类型；两个腺苷供体——pApAm和D1硫代磷酸酯立体异构体pApsAm——表现最佳，在HEK293中使累积GLuc产量提高至163%，在A549中提高至79%。这些结果确立了二核苷酸连接作为一种最小化且模块化的3′末端工程方法alle（approach），能够增强对去腺苷酸化的抗性并改善治疗性mRNA候选物的翻译性能。

mRNA作为潜在药物的应用自20世纪90年代起即被探讨。由于技术进步，mRNA已成为疫苗开发和蛋白质替代疗法中极具前景的工具，尤其在SARS-CoV-2大流行期间展现了mRNA疫苗的巨大潜力。相较于传统方法，体外转录（in vitro transcribed, IVT）mRNA具有低成本、快速生产、无感染或插入突变风险等优势，且可通过多种修饰提高其体内稳定性与翻译潜能。目前，mRNA药物的核心挑战在于其高度不稳定性，因核糖核酸酶（ribonucleases, RNases）无处不在地降解RNA。无论何种降解途径，哺乳动物细胞中mRNA降解均由去腺苷酸化起始，该过程主要由CCR4-NOT复合物执行，且日益被认为是整合mRNA周转与翻译调控的转录后枢纽。聚腺苷酸尾通过蛋白质-RNA相互作用保护mRNA编码区免于降解，并在翻译起始过程中发挥重要作用。近年研究表明，聚腺苷酸尾可通过其组成和动态变化编码调控信息，包括非腺苷残基的存在和位置，这为最小化3′末端干预提供了概念基础。

研究人员在本研究中开发了一种新型化学酶促方法修饰mRNA 3′末端。研究人员合成两组5′-单磷酸化二核苷酸，包含腺嘌呤（A）或鸟嘌呤（G）碱基，每组含三种不同修饰的化合物：均含2′-O-甲基化，分别联合常规磷酸酯（pApAm/pGpGm）或硫代磷酸酯键（两个pApsAm立体异构体或两个pGpsGm立体异构体）。首先，研究人员通过酶促连接将各二核苷酸化合物整合入12聚体寡聚腺苷酸类似物（A12 OA）的3′末端，所得14聚体产物经特异性降解敏感性测试。随后，相同二核苷酸化合物连接至编码Gaussia荧光素酶（GLuc）报告蛋白的mRNA 3′末端，再次测试其对去腺苷酸酶活性的抗性，并在兔网织红细胞裂解液系统和三种细胞系中进行蛋白表达实验。

短寡聚腺苷酸类似物3′末端二核苷酸修饰完全抵抗重组CNOT7去腺苷酸化作用。研究人员旨在以小型、易获得的化合物实现mRNA酶促稳定性和翻译潜能的提升，这些化合物可连接至任何RNA链的3′末端。基于前期结果，研究人员选择2′-O-甲基化和5′,3′-硫代磷酸酯两种核苷酸修饰引入5′-单磷酸化5′,3′-二核苷酸，使其在酶促连接反应中作为供体。T4 RNA连接酶1可将其底物——即5′端具有磷酸基团且3′端为游离-OH的RNA——与化学修饰的寡核苷酸连接。鉴于真核去腺苷酸酶对聚腺苷酸链具有高度底物偏好性或间接依赖性，研究人员设计了含腺嘌呤或鸟嘌呤核碱基的化合物。所有5′-单磷酸化二核核苷酸（pApAm、pApsAm立体异构体D1和D2、pGpGm、pGpsGm立体异构体D1和D2）均通过固相合成获得，D1为R_P构型，D2为S_P构型。连接反应中，5倍摩尔过量二核苷酸供体即完成A12底物向14聚产物的完全转化；pGpsGm D2供体产生少量双连接产物，源于2′-O-甲基化阻碍但未能完全阻断3′,5′-磷酸二酯键形成。主要连接产物经反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化。降解测试显示，与逐渐缩短的未修饰A12链不同，所有修饰14聚体在CNOT7存在下保持稳定，证实3′末端化学修饰二核苷酸可保护聚腺苷酸链免受CNOT7酶活性及潜在其他3′→5′核酸外切酶的攻击。

经3′末端二核苷酸修饰的mRNA在体外对CNOT7不敏感。针对完整mRNA，研究人员优化了连接方案：将二核苷酸过量从5倍提高至100倍，添加15% PEG800增加分子拥挤效应以加速连接，并将孵育时间从过夜缩短至1小时以避免mRNA暴露于不利条件。选择编码Gaussia荧光素酶（GLuc）的mRNA作为报告系统，该mRNA 5′端以cap-1类似物（m⁷GpppAmG）加帽，3′端含约150 nt聚腺苷酸尾，经RP-HPLC纯化以去除双链RNA污染物。经改进方案连接后，mRNA样品通过Monarch RNA纯化柱纯化。与14聚体寡核苷酸结果一致，连接修饰mRNA在CNOT7去腺苷酸化测试中保持稳定，而未修饰对照样品因聚腺苷酸尾移除而缩短。

mRNA 3′末端二核苷酸修饰提高细胞翻译效率。在确认所有连接mRNA高度抵抗去腺苷酸化后，研究人员假设至少部分修饰可通过阻碍聚腺苷酸短缩进而延长功能性mRNA寿命，从而提高蛋白产量。为兼顾不同细胞系的翻译机制、mRNA降解速率和转染效率差异，研究人员选择了三种来源和形态迥异的细胞系：A549人肺腺癌细胞、JAWSII树突状细胞（用于抗肿瘤疫苗免疫应答模型）以及HEK 293人胚肾细胞（高翻译和蛋白生产水平）。细胞实验前，所有修饰mRNA在兔网织红细胞裂解液（RRL）系统中进行翻译效率检测，结果显示所有修饰mRNA翻译水平与未修饰GLuc mRNA相似或略高；鉴于RRL系统中mRNA降解机器减至最低，此结果证实3′末端修饰未显著干扰翻译机器。

细胞实验显示，蛋白表达量因mRNA类型和细胞系而异。在A549细胞中，仅mRNA A2（pApsAm D1）翻译潜能高于对照（蛋白产量增加79%），其余修饰与对照相似，表明或修饰未稳定mRNA、或稳定性增强带来的翻译提升被3′末端修饰对翻译过程的负面影响抵消。在JAWSII细胞系中，仅mRNA A1（pApAm）增强翻译（70%），而pApsAm的D1（mRNA A2）和D2（mRNA A3）立体异构体均降低翻译水平，D2降低40%；鸟苷二核苷酸连接mRNA（G1、G2、G3）输出与对照相似。在HEK 293细胞中差异最为显著：mRNA A1和A2分别使蛋白表达提高105%和163%，mRNA A3再次表现最差；mRNA G1翻译效率亦很高（提升118%），G2和G3分别提升65%和49%。这种显著的细胞类型依赖性符合CCR4-NOT介导去腺苷酸化速率可通过衔接蛋白招募和信号输入调控的机制证据，提示不同3′末端修饰在不同细胞环境中对翻译和降解平衡的影响可能存在差异。总体而言，pApAm（mRNA A1）和pApsAm D1（mRNA A2）两个二核苷酸在翻译输出增强方面表现最佳：pApAm在JAWSII和HEK293细胞系中均有提升，pApsAm D1则在A549和HEK293细胞系中有效；pGpGm修饰亦显示益处，且可能因非腺苷碱基而具有更强的去腺苷酸酶稳定性。

3′末端二核苷酸修饰增加mRNA胞质稳定性。为探究3′末端修饰是否影响mRNA胞质稳定性，研究人员采用显微注射而非转染后定量PCR的方法，以避免转染动力学和内体捕获mRNA的干扰。将编码荧光报告蛋白eGFP的未修饰mRNA和A2修饰mRNA（eGFP-pApsAm D1）直接显微注射入A549细胞胞质，通过共聚焦显微镜监测翻译活性随时间变化，并利用数学建模估算蛋白和mRNA半衰期（t_dp和t_dm）。基于一阶动力学方程，数据表明修饰mRNA的估计半衰期约为未修饰对照的两倍：eGFP-pApsAm D1的t_dm约66-71小时，而eGFP约27-28小时。这与GLuc-pApsAm D1在A549细胞中总体蛋白产出增加的结果高度吻合，表明此类3′末端修饰可显著延长mRNA的胞质半衰期。

研究结论部分指出，研究人员开发了一种简单高效的转录后策略，利用酶促连接短链化学修饰的5′-磷酸化二核苷酸来工程化合成mRNA的3′末端。研究人员设计并合成了六种二核苷酸供体（A-和G-碱基），各在第二个核苷酸携带2′-O-甲基化修饰，部分还含立体明确的硫代磷酸酯键。通过T4 RNA连接酶1，这些供体被连接至短寡聚腺苷酸模型（A12）和携带约150 nt聚腺苷酸尾的IVT Gaussia荧光素酶（GLuc）mRNA的3′末端。两种格式下，3′末端二核苷酸安装均赋予对CNOT7介导去腺苷酸化的强抗性，而未修饰对照mRNA发生了聚腺苷酸尾移除。在哺乳动物细胞中，对蛋白输出的影响取决于二核苷酸结构和细胞环境。测试构建体中，两个腺苷基供体（A1和A2）在跨细胞系中yielded最一致的报告基因产量增加。A2修饰在显微注射入A549细胞后也增加了mRNA半衰期。综合而言，这些结果表明最小化3′末端修饰可有效保护聚腺苷酸尾免受体外酶促短缩，并在有利环境中提高活细胞蛋白产量，无需改变编码序列。未来工作应将这一方法扩展至更多mRNA货物和递送环境中，包括体内模型，并直接定量细胞中mRNA丰度/功能寿命，以进一步阐明去腺苷酸化敏感性与蛋白输出之间的关系。