《RSC Chemical Biology》：Stability modification of therapeutic aptamers: from biostability bottlenecks to nuclease-resistant construct design
核酸适配体（aptamers）是合成的、单链的寡核苷酸（oligonucleotides），能以高亲和力和特异性结合靶标，实现精确且可编程的功能调节。然而，低生物稳定性（biostability）仍然是治疗性适配体（therapeutic aptamers）的一个关键成药性（druggability）瓶颈。体内酶不稳定性（enzymatic lability）构成了主要的药代动力学（pharmacokinetic）屏障，阻碍了全身暴露（systemic exposure）、组织分布（tissue distribution）和持续靶点占据（sustained target occupancy），这些都是体内疗效（in vivo efficacy）的关键决定因素。因此，通过耐酶修饰（enzyme-resistant modifications）进行合理化学稳定化（rational chemical stabilization）已成为适配体药物开发的核心策略。在本综述中，研究人员系统地将当前的稳定化方法归纳为两个互补的设计维度：局部水平修饰（包括末端修饰（terminal modification）、糖修饰（sugar modification）、骨架修饰（backbone modification）和碱基修饰（base modification））以及全局结构水平工程（包括镜象寡核苷酸（Spiegelmers）、环化修饰（cyclization modification）和多价组装（multivalent assembly））。此外，研究人员讨论了持续的转化挑战，以阐明设计高生物稳定性（biostability）适配体的连贯框架，这些适配体应实现增强的核酸酶抗性（nuclease resistance），同时表现出良好的药代动力学（pharmacokinetics）、高靶点结合亲和力（target binding affinity）和特异性（specificity）。
1. 引言
适配体（aptamers）是合成的单链DNA或RNA寡核苷酸，能够折叠成特定的三维构象，以高亲和力和特异性结合分子靶标（最常为蛋白质）。与主要依赖序列互补碱基配对的反义寡核苷酸或siRNA不同，适配体通过结构依赖的分子识别发挥作用：发夹、内环、连接点、假结和G-四链体（G-quadruplexes）等三级基序协同作用，形成可区分靶标细微理化特征的形状结合表面。由于适配体在保持完全化学可编程性和固相合成可制造性的同时，可近似抗体样的靶标结合，因此常被称为“化学抗体”。发现适配体的主要方法是系统性进化配体指数富集（SELEX），该方法通过重复的结合、分离和扩增循环，从高度多样化的随机文库中富集稀有靶标结合序列。自引入以来，SELEX已发展为日益标准化的流程，受益于选择设计（例如更严格的负选择）、加速富集追踪的分析读数以及自动化友好格式的改进。从药物开发角度看，适配体在小分子和生物制品之间占据独特位置：它们可通过可规模化的化学合成生产，具有强批次一致性；其核酸支架支持位置定义的模块化化学工程，允许在预定位置安装功能基团、连接子、成像标签或药物载荷；同时，适配体可通过构象编码的识别表面实现纳摩尔甚至皮摩尔结合亲和力及出色选择性。原则上，这种可编程性、可制造性和高性能结合使适配体成为细胞外阻断、受体调节、靶向递送和多特异性治疗组装的理想配体。
2. 低生物稳定性是治疗性适配体的关键成药性瓶颈
低生物稳定性仍是治疗性适配体的关键成药性瓶颈。尽管适配体在体外可实现高亲和力和特异性，但其体内功能取决于在生理条件下维持序列完整性和结合能力的三级折叠。由于适配体识别是构象驱动的，部分降解对于某些线性寡核苷酸模态可能可容忍，但对适配体而言可能具有功能灾难性：在结构关键的环、连接点或稳定茎区域的切割可触发全局解折叠并迅速丧失靶标结合。
2.1 核酸酶介导的降解途径
适配体低生物稳定性的主要机制是由生物液体和组织中的核酸酶介导的降解。内切核酸酶切割内部的磷酸二酯键，而外切核酸酶从3′和/或5′端渐进式修剪寡核苷酸。这些过程在体内同时发生，产生的截断片段可能无法维持必要结构基序以保持高亲和力识别。重要的是，核酸酶攻击无需广泛即可消除功能：单一内部切割或适度的末端修剪可破坏长程三级接触并 destabilize 活性折叠。RNA适配体通常比DNA适配体更易受攻击，因为除丰富的RNase活性外，2′-羟基基团增加了内在骨架不稳定性并可能加速裂解反应。DNA适配体缺乏2′-OH，因此倾向于表现出更好的内在稳定性，但根据序列背景和折叠拓扑，仍可能经历快速降解。
2.2 结构-稳定性耦合与生物学功能丧失
适配体的一个定义特征是结构与功能的紧密耦合：亲和力和特异性来源于核苷酸的精确三维排列。这种耦合使适配体对降解特别敏感。末端修剪可去除稳定茎和共轴堆叠的碱基配对元素；内部切割可坍塌组织结合界面的环结构和多螺旋连接点；局部不稳定化可传播至全局构象重排。因此，降解的功能影响可能是非线性的——尤其是对于结构敏感的适配体（例如采用茎-环构象的适配体），即使轻微化学损伤也可能产生不可预测的结合亲和力丧失、结合动力学改变或特异性降低。这种结构-稳定性关系解释了为什么提高核酸酶抗性通常是维持适配体在复杂生物基质中活性并实现治疗性靶标结合的前提。
2.3 转化意义：为何稳定性修饰嵌入高级构建体
由于未修饰适配体易受快速核酸酶降解，稳定性修饰通常在治疗设计中早期整合，而非作为后期优化处理。在临床前晚期研发或临床评估中推进的适配体很少是“裸”寡核苷酸；相反，它们是工程化构建体，包含稳定性修饰元素以在体内维持活性折叠和靶标亲和性。一个典型例子是pegaptanib，首个FDA批准的适配体治疗药物，其药物样行为依赖于整合的修饰堆叠而非单一天然序列。更广泛地，实际转化设计常采用多种互补稳定性修饰，反映了一个实用原则：稳健的核酸酶抗性通常需要针对外切和内切核酸酶途径的组合保护，同时维持结合的结构决定因素。表1总结了已上市和代表性临床阶段适配体治疗药物及其各自构建体中使用的稳定性修饰堆叠。
3. 增强适配体核酸酶抗性的稳定性修饰策略
基于第2节讨论的核酸酶驱动机制，本部分总结了在维持结合活性折叠的同时增强抗降解能力的适配体稳定性修饰策略。聚焦两个互补设计层面：（i）直接降低核酸酶易感性的内在化学修饰和末端保护，以及（ii）主要通过位阻屏蔽和构象约束改善稳定性的构建体水平工程——如末端共轭、环化、手性反转和多价组装。
3.1 末端稳定性修饰与末端共轭
末端稳定性修饰主要通过遮蔽游离3′/5′端来保护适配体免受外切核酸酶修剪，方式包括小分子末端加帽或产生位阻的末端共轭。
3.1.1 生物素修饰
用生物素（维生素B7）修饰3′端是一种广泛使用的策略。生物素通过位阻效应提供保护，阻止3′-外切核酸酶（如蛇毒磷酸二酯酶）与游离3′-羟基结合。例如，针对SARS冠状病毒解旋酶的DNA适配体NG8的3′-生物素修饰使其在5%和10%胎牛血清中的稳定性分别从16小时和6小时延长至31小时和16小时。链霉亲和素可通过与生物素的高亲和力非共价相互作用增强位阻，同时增加分子量以降低肾清除率。在靶向人α-凝血酶的DNA适配体中，3′-生物素-链霉亲和素修饰在体外和体内均显著降低降解效率（降低10至20倍），同时保留对凝血酶的亲和性。
3.1.2 3′–3′连接修饰（倒置脱氧胸苷（idT）修饰）
3′–3′连接也称为倒置脱氧胸苷（idT）修饰。idT修饰涉及在寡核苷酸3′端添加倒置胸苷帽，阻止3′-OH暴露，从而保护适配体末端免受外切核酸酶消化。idT是目前最常见的修饰，广泛用于已上市药物Macugen和临床阶段候选药物。该修饰方法最初由Shaw等人报道，应用于11聚体寡核苷酸序列显著提高血清稳定性。与单3′-生物素修饰的NG8相比，单idT修饰的NG8表现出更强的外切核酸酶抗性。
3.1.3 修饰核苷酸加帽修饰
修饰核苷酸通常通过化学合成在SELEX前引入序列中以赋予内切核酸酶抗性，但近期后SELEX的3′端修饰成为特异性防止3′→5′外切核酸酶降解的策略。Kasahara等人系统评估了几种桥连核苷酸（BNA）类似物（包括锁核酸（LNA）和苯基取代BNA）对凝血酶结合适配体TBA1酶稳定性的影响。在蛇毒磷酸二酯酶中，LNA加帽使稳定性提升3.6倍，苯基-BNA加帽提升27倍；在人血清中分别提升1.5倍和3.3倍。Wen等人报道的新型修饰核苷酸eTNA结合了idT和TNA的结构特征，应用于DNA适配体后在蛇毒磷酸二酯酶中72小时无降解，在50%人血清中半衰期从27.6分钟延长至24.2小时，且优于idT 2.3倍。
3.1.4 聚乙二醇化（PEG）修饰
PEG修饰通常用于限制寡核苷酸的肾滤过率，因其显著增加分子量，修饰常位于5′端。在血清稳定性方面，PEG通过形成水化位阻屏障热力学排斥核酸酶接近易感磷酸二酯骨架，从而抵抗5′端外切核酸酶降解。Hoffmann等人首次将单线性PEG偶联至手性反转RNA适配体NOX-E36并验证其更好的核酸酶抗性。Haruta等人开发了对称分支2-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺PEG化（sbC-PEGylation）方法，应用于靶向IL-17A抑制剂的RNA适配体，在小鼠及猴中表现出优于未修饰及仅双分支PEG偶联的稳定性。Zhang团队报道的含有高度支化PEG修饰的聚丝氨醇磷酸二酯（PSP）聚合物辅助压缩（pac）适配体，在小鼠中药代动力学显示PSP pac HD1在血液中持续时间显著长于游离HD1，总药物暴露（AUC
0→∞）差异达16倍，且避免了传统线性PEG修饰的免疫原性。
3.1.5 脂质修饰
胆固醇缀合是最广泛研究的基于脂质的适配体稳定性修饰之一。胆固醇部分与循环脂蛋白（如LDL和HDL）结合，产生位阻屏蔽减少核酸酶进入，从而减缓外切核酸酶驱动修剪。Smidt等人首次证明胆固醇修饰寡核苷酸锚定于人血浆分离的LDL和HDL表面，胆固醇缀合使大鼠血浆半衰期延长约10倍，并延迟降解。Aliyu等人使用三甘醇（TEG）连接子将胆固醇缀合至DNA适配体OKA_24的3′端及OKA_26的5′端，两者均表现出改善的血清核酸酶抗性。二酰基甘油（DAG）作为脂质修饰需外源脂质稳定系统，将适配体嵌入脂质体双层以物理遮蔽核酸酶攻击。Willis等人将DAG-NX213（VEGF结合RNA适配体）通过超声掺入脂质体，在RNase T1攻击下约三分之一保持保护状态，而游离DAG-NX213完全被切割；体内半衰期较裸适配体延长。
3.1.6 半乳糖苷化修饰
糖基化修饰寡核苷酸策略代表活性组织靶向治疗的前沿。与三价N-乙酰半乳糖胺（Tri-GalNAc）结构缀合的适配体已被证明可高亲和力特异性靶向肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）。Tan团队开发了糖核酸适配体（GNAA）策略，通过Sonogashira交叉偶联将糖苷部分连接至适配体尿嘧啶环的不同位置，应用于靶向PTK7蛋白的DNA适配体Sgc8。3′和5′端糖基化修饰（尤其是GalNAc末端修饰）可比未修饰Sgc8提高血清稳定性达14倍，且维持结构和高亲和力。分子动力学模拟揭示GalNAc 3′修饰的Sgc适配体与外切核酸酶I（EXO1）的相互作用机制：碱基与EXO1残基的相互作用从6个减少至3个，降低了适配体与核酸酶的结合亲和力，增强酶解抗性。
3.2 糖环修饰
糖环修饰是适配体工程中提高核酸酶抗性、热稳定性和整体药代动力学性质的关键方法。这些修饰靶向核糖部分，通常赋予结构刚性或灵活性以优化生物环境中的结合亲和力和持久性。
3.2.1 2′-F、2′-NH
2和2′-OMe修饰
核糖2′位置的修饰（最常见为2′-氟（2′-F）、2′-氨基（2′-NH
2）和2′-O-甲基（2′-OMe））是应用最广泛的适配体稳定性修饰之一。这些取代替换了天然2′-羟基基团（许多RNase识别和利用的结构特征），从而减少有效酶-底物相互作用并减缓骨架切割。在凝血酶适配体中，2′-F掺入与胎牛血清中抗降解能力增强相关，部分情况也改善了结合性能。2′-NH
2取代显著提高了针对人中性粒细胞弹性蛋白酶和血管内皮生长因子的适配体的血清稳定性。2′-OMe修饰在维持结合性能的同时可大幅改善核酸酶抗性，常与2′-F组合用于临床优化设计（如抗VEGF适配体）。不同2′化学的免疫学谱可能存在差异，2′-F在某些背景下报道有更高的先天免疫激活风险，而2′-OMe常被认为免疫沉默。
3.2.2 4′-硫代修饰
4′-硫代修饰将糖环中的4′-氧替换为硫，显著增强对RNase的抗性而不损害结合特异性。采用4′-硫代UTP和4′-硫代CTP进行体外选择产生了具有优越稳定性的硫代RNA适配体。一个4′-硫代修饰的抗凝血酶适配体对RNase A的抗性提高了50倍，同时保持高亲和力结合（Kd = 4.7 nM）。
3.2.3 锁核酸（LNA）
锁核酸（LNA）在2′-氧和4′-碳之间引入亚甲基桥，将核糖约束在3′-内构象，从而提高热稳定性和降解抗性。这种刚性结构增加了双链熔解温度和核酸酶抗性。在采用突变T7 RNA聚合酶的选择中，LNA-T和LNA-A掺入（常与2′-F嘧啶配对）产生了靶向流感血凝素和人CD40配体的适配体，亲和力达低纳摩尔，在25%人血清37°C中4天后降解<20%。然而，高LNA含量具有序列依赖性，环中的修饰可能对稳定性贡献较小，且LNA在某些背景下存在肝毒性风险。
3.2.4 解锁核酸（UNA）
解锁核酸（UNA）破坏核糖环中的C2′–C3′键，引入无环灵活性以促进构象调整和诱导契合结合机制。UNA降低双链热稳定性但增强适配体适应性，可改善对某些靶标的亲和力。在31核苷酸抗凝血酶DNA适配体RE31中，在T15位置掺入UNA-C使Kd从1.34 nM改善至0.43 nM，其他UNA变体也有类似提升。UNA可微调含G-四链体适配体的稳定性和结合，但在某些结构中可能 destabilize 三链体形成。
3.2.5 苏糖核酸（TNA）
苏糖核酸（TNA）采用简化的四碳糖（苏糖），磷酸骨架直接连接至3′碳，赋予相比DNA或RNA更强的酶解抗性。TNA支持Watson-Crick碱基配对同时提高生物稳定性。酶抗性实验显示TNA探针可抵抗困扰DNA对应物的降解。通过聚合酶在DNA寡核苷酸3′端延伸TNA可产生对外切核酸酶I高度抗性的嵌合体。此外，TNA在酸性条件下比RNA具有更高的酸稳定性。
3.2.6 阿拉伯核酸（ANA）与2′-F-ANA（FANA）
阿拉伯核酸（ANA）及其2′-氟衍生物（FANA）是2′取代基在“向上”（阿拉伯糖）构型的立体异构体，与天然“向下”（核糖）形式不同。这些修饰增强核酸酶抗性和热稳定性，同时在与RNA杂交时可激活RNase H，适用于基因沉默治疗。ANA/RNA杂合体作为RNase H底物促进靶标切割。FANA与RNA杂交强，诱导RNase H介导降解，并显示高血清稳定性；硫代磷酸FANA常用于反义寡核苷酸。靶向HIV-1整合酶和逆转录酶的FANA适配体具有低纳摩尔亲和力和构象刚性。
3.3 磷酸二酯键修饰
磷酸二酯键修饰通过改变磷酸骨架增强核酸酶抗性，通常通过取代非桥连氧或用耐核酸酶正交连接替代天然连接。代表性方法包括甲基膦酸酯、硫代磷酸酯取代以及通过点击化学引入的三唑骨架。
3.3.1 甲基膦酸酯
甲基膦酸酯（MP）修饰将磷酸基团中的一个非桥连氧原子替换为甲基取代基，改变骨架化学以降低核酸酶识别和切割。MP连接常用于增强抗核酸酶降解能力，尤其针对外切核酸酶修剪。含MP的类似物（尤其是结合末端倒置帽）在人血清中稳定性显著提高。然而，MP修饰并非对所有适配体折叠均稳定：由于还原骨架负电荷密度，MP取代可能 destabilize 某些构象（特别是G-四链体结构）。因此，MP连接通常置于需要核酸酶保护但功能折叠扰动最小的区域。
3.3.2 硫代磷酸酯
硫代磷酸酯（PS）修饰将磷酸骨架中的一个非桥连氧原子替换为硫，生成P–S键，对核酸酶催化水解的易感性远低于天然磷酸二酯键。PS取代广泛用于增强适配体在血清和血浆中的核酸酶抗性。PS修饰的适配体在血浆中降解显著减慢，额外位阻屏蔽（如生物素-链霉亲和素体系）可进一步降低降解速率。PS取代通常部分应用以平衡稳定性收益与活性折叠的保留。例如，在凝血酶结合适配体的环或核酸酶可及区域引入PS连接，可保持功能活性同时提高抗DNase挑战能力。然而，广泛PS/PS2取代并非普遍耐受：PS在磷原子引入手性产生非对映体混合物，高取代水平与某些寡核苷酸背景中的脱靶相互作用和毒性增加相关。
3.3.3 点击化学引入的三唑骨架
三唑骨架通过铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）合成，完全取代磷酸二酯连接为1,2,3-三唑单元，形成天然核酸酶无法识别的人工支架，高度抗降解。三唑连接的DNA（TLDNA）或RNA（TLRNA）对5′/3′-外切核酸酶（如DNase或蛇毒磷酸二酯酶）具有优越抗性。在适配体中，三唑整合（常与锁核酸组合）维持双链形成并增强与RNA/DNA互补体的结合，如靶向凝血酶的G-四链体结构或杂合三链体。中性骨架减少阴离子电荷，改善细胞摄取和生物相容性。然而，碱基间距离的变化可能破坏高亲和力结合所需的精确堆叠相互作用，通常限制其在短、非结构化区域的应用。无铜变体减轻毒性，模板化CuAAC可实现高效连接用于适配体环化。
3.4 碱基修饰
碱基修饰通过引入化学基团改变核苷酸结构，增强核酸酶抗性，同时可能改善结合亲和力和药代动力学。凝血酶结合适配体（TBA）是最著名的G-四链体形成适配体之一。8′碳修饰的鸟嘌呤（如溴取代）通过稳定G-四链体结构增强抗酶特性。Plavec等人研究了在TBA中掺入芘修饰尿苷核苷酸（Upy）的结构和功能效应。缓慢解离速率修饰适配体（SOMAmer）技术代表核酸与蛋白质化学之间的重大突破。SOMAmers在尿嘧啶5′位置修饰有大体积疏水侧链（如苄基、萘基、色氨酸和异丁基），形成类似球蛋白的“疏水核心”，稳定三级结构并空间保护骨架。这种化学扩展使适配体形成复杂疏水和π–π堆叠相互作用，产生极慢解离速率（结合半衰期数小时至数天）和皮摩尔甚至飞摩尔亲和力。
3.5 适配体手性反转（Spiegelmers）
适配体手性反转以Spiegelmers为代表，使用L-核酸创建镜像寡核苷酸，增强生物稳定性同时保持高亲和力结合。Spiegelmers由L-核苷酸组成，形成左手螺旋结构。其开发采用“镜像”SELEX策略：针对靶标的对映体（D-形式）选择D-寡核苷酸文库，然后以L-构型化学合成所得适配体序列以结合天然靶标。这种手性反转赋予卓越的核酸酶抗性，因为酶是立体特异性的，无法有效识别或水解L-核酸。稳定性研究显示Spiegelmers在37°C人血清中完整保持超过60小时，体内半衰期超过50小时。附加修饰（如PEG化）进一步延长药代动力学。Spiegelmers通过形状识别和三级相互作用保留高结合亲和力，通常为皮摩尔至纳摩尔范围。例如，针对VEGF-165的Kd低至0.65 pM，对IFN-γ为0.038 nM。临床进展示例包括NOX-A12（olaptesed pegol）靶向CXCL12/SDF-1抑制胶质母细胞瘤和慢性淋巴细胞白血病（CLL）肿瘤进展；NOX-E36（emapticap pegol）拮抗CCL2减轻糖尿病肾病炎症；NOX-H94（lexaptepid pegol）靶向hepcidin治疗慢性病贫血。
3.6 适配体环化
适配体环化将线性寡核苷酸序列转化为环状形式，消除易感性核酸酶攻击的游离3′和5′端。原理是增加结构刚性和均质性，通过封闭环阻止酶进入末端，同时维持或改进适配体的构象完整性用于靶标结合。研究重点在创新环化技术，如CuAAC和光化学锁定，创建稳定环状适配体且亲和力损失最小。进展包括仿生模板指导连接用于单轮选择环状适配体，整合L-RNA提供镜像核酸酶保护。环状二价适配体熔解温度比双链前体提高>10°C，小鼠模型中肿瘤滞留增强。光化学稳定适配体改善了肿瘤治疗小鼠模型的偶联效率。
3.7 多价适配体
多价适配体通过间隔子或支架连接多个适配体单元（相同或异质），利用亲合力效应增强性能。这些分子依赖协同结合，多个相互作用使整体亲和力常提高100倍；更大尺寸提高核酸酶抗性、降低清除率，并通过受体簇集和内吞促进增强细胞摄取。圆形多价结构和DNA纳米结构常被报道用于精确表位靶向，增强血清稳定性。点击化学用于高效组装，异质多价设计结合EGFR和PD-L1等双靶标可改善免疫治疗协同。Tan团队报道了多价AptLYTAC平台，使用生物素-链霉亲和素作为分子支架，三价设计相比单价实现更高靶蛋白降解效率。Bastings团队开发了多价进化DNA基超分子组装（MEDUSA）策略，通过进化过程中直接引入几何匹配的DNA支架实现多价结合能力的协同筛选。多价适配体相比双特异性抗体具有快速低成本化学合成、优越组织穿透性及易于模块化工程的优势，但仍面临核酸酶残留易感性、快速肾清除和临床转化数据有限等瓶颈。
4. 讨论与展望
稳健的体内性能很少通过单一修饰实现，而是需要对互补策略进行合理堆叠，以平衡核酸酶抗性与亲和力和可开发性。在适配体工程中，药效学效应由两个相互依赖但常竞争的参数控制：核酸酶抗性和靶标结合亲和力。尽管某些化学修饰（如2′-F和2′-F阿拉伯核苷酸（FANA））可同时增强稳定性和亲和力，但亲和力降低仍是许多稳定性修饰策略的常见结果。这种权衡首次在反义寡核苷酸（ASO）中观察到，其中硫代磷酸酯（PS）骨架修饰提高核酸酶抗性但常降低杂交亲和力。在适配体中，Ruckman等人提供了直接证据：对VEGF结合RNA适配体t2.29进行广泛2′-OMe修饰使Kd增加3.5倍，t44.27从10 pM增至49 pM。这表明稳定性、结合性能和可开发性之间存在关键权衡。化学修饰有效增强核酸酶抗性和血清半衰期，但常引入结构扰动降低靶标亲和力或特异性。相反，未修饰适配体遭受低生物稳定性和快速清除，严重限制其药物样性质。SELEX前策略（在文库构建中掺入修饰核苷酸）通过进化固有稳定和功能序列提供有前景的解决方案，但限制了结构多样性、显著增加筛选复杂性并降低整体成功率。因此，稳定性工程不应追求全局最大保护，而应通过理性混合方法平衡这些因素——例如基于结构洞察的最小后SELEX修饰，或先进DNA纳米结构支架以确保核酸酶抗性同时维持治疗性适配体的折叠结构和优异结合性能。
机器学习模型和其他计算机工具的快速发展在预测适配体结构和模拟靶标-适配体对接方面显示出巨大潜力。然而，目前尚无验证框架可定量预测酶抗性稳定性修饰如何根据修饰位点、密度和组合模式重塑结合热力学和动力学。因此，稳定化适配体设计仍严重依赖经验合成和筛选，拖慢转化并增加成本——尤其在多个化学修饰堆叠时。加速修饰位点选择的实用近期策略包括：（i）在相关生物基质下进行核酸酶“热点”定位，以优先保护最早切割位点；（ii）结构感知、区域特异性规则，保护末端和核酸酶暴露的环/连接点，同时保守修饰结构骨架；（iii）扫描-堆叠工作流（小窗口扫描后选择性堆叠）以避免组合爆炸。这些工作流产生的系统数据集也将使未来模型能够显式学习修饰-结构-结合关系。
关于适配体稳定工程和安全性评估，核酸治疗药物固有惰性的假设已受到临床前和临床中修饰相关不良事件的挑战。例如，含LNA的寡核苷酸在某些背景下显示剂量依赖性肝毒性。PEG缀合可触发抗PEG抗体和严重超敏反应；该风险导致Pegnivacogin（甲氧基PEG缀合RNA适配体靶向因子IXa）因危及生命的过敏反应在II期终止。与此同时，密集修饰堆叠增加合成复杂性并可能损害产率和可重复性，削弱适配体的制造优势。新兴缓解策略因此强调使用生物相容性载体（如纳米粒子、脂质体）提供位阻屏蔽和持久性，同时维持天然适配体折叠，从而减少对重修饰构建体的需求。总体而言，进展可能来自将最小、热点聚焦的稳定性修饰与数据指导的位点选择以及考虑安全性和可制造性约束的风险意识化学选择相结合。
