一种新的4原子连接子实现PROTAC开发与成像

《RSC Chemical Biology》：A new 4-atom linker enables PROTAC development and imaging

　　

蛋白质靶向嵌合体（PROTACs）是异双功能分子，正在成为一类有前景的药物。在其结构组分中，连接子（linker）部分在调节其生物活性和理化性质方面起着关键作用。当前的PROTAC设计策略涉及使用更短且更刚性的连接子，以限制三元复合物中可能的构象数量。研究人员假设，在两个配体之间采用短二炔间隔子（diyne spacer）作为连接子，可以生成高效PROTACs。在此，研究人员报告了一系列含有二炔的、低纳摩尔范围的BRD4降解剂，这些降解剂招募CRL4CRBN E3连接酶复合物。除了提供高活性降解剂外，拉曼活性二炔部分还能够通过受激拉曼散射（SRS）显微镜在低微摩尔浓度下实现细胞内药物摄取的无标记可视化。这项工作展示了基于二炔的PROTAC连接子在药物开发以及解决该领域关键挑战——理解PROTACs的细胞摄取机制和细胞内定位——方面的潜力。

蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术通过连接子（linker）将目标蛋白配体与E3泛素连接酶配体连接，利用泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解靶蛋白，是新兴药物开发策略。然而，连接子的长度、刚性和化学性质对PROTAC活性和理化性质影响显著，优化过程耗时费力。此外，高分辨率观察PROTACs在细胞内的定位和摄取机制仍是一个未充分探索的关键挑战。为应对这些问题，研究人员设计了含有4个原子的刚性二炔（diyne）连接子，既期望生成高效PROTACs，又希望利用其拉曼活性实现无标记成像。以Spyros Letsios、Giovana Carrasco等为代表的研究团队，在《RSC Chemical Biology》上发表论文，报道了一系列基于二炔连接子的CRBN招募BET蛋白降解剂。研究证实，二炔连接子能生成低纳摩尔活性的BRD4降解剂，且通过受激拉曼散射（SRS）显微镜在低微摩尔浓度下实现无标记细胞成像，揭示了细胞内定位特征。这项研究为PROTAC连接子设计提供了新策略，并首次将二炔拉曼标签应用于PROTAC成像，助力理解细胞摄取和定位机制。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：有机合成（通过Cadiot-Chodkiewicz偶联等构建二炔连接子PROTACs）、Western blot分析（检测BRD2/3/4蛋白降解水平）、高内涵共聚焦成像（定量BRD4 puncta变化）、全细胞蛋白质组学（评估降解选择性）、表面等离子体共振（SPR）测量三元复合物结合动力学与协同性、分子动力学模拟（预测三元复合物结构）、受激拉曼散射（SRS）显微镜（无标记成像药物分布）。所有细胞实验均使用HeLa细胞系。

研究结果按小标题总结如下：

**Design and synthesis of diyne containing PROTACs**
利用pan-BET抑制剂（JQ1类似物）的两个退出向量（苯环对位和酯基部分），通过Cadiot-Chodkiewicz偶联分别连接二炔间隔子，合成了四种CRBN招募的PROTACs（化合物2、3、4、5）。其中，将连接子连接在苯环对位的化合物2和3，以及连接在酯基部分的化合物4和5，均获得了毫克级高纯度产物（≥95%）。

**PROTACs bearing short diyne linkers are highly potent BET degraders**
通过Western blot分析，化合物2和3在0.1 μM和1.0 μM浓度下显著降解BRD4，效果与已知阳性对照相当；而化合物4和5仅部分有效。全细胞蛋白质组学分析显示，30 nM处理6 h后，化合物2最显著下调BRD4，而化合物3同等下调BRD2、BRD3和BRD4，表明化合物2具有更高选择性。

**Dose and time-dependent BRD4 degradation via the UPS**
剂量-反应实验表明，化合物2和3在300 nM时达到>90% BRD4降解，DC₅₀值分别为35 nM和36 nM；在高浓度下出现钩状效应。时间依赖实验显示，0.03 μM处理12 h后降解超过80%。机制验证中，蛋白酶体抑制剂和NEDDylation抑制剂完全阻断降解，过量CRBN配体部分保护BRD4，证实降解通过UPS和CRBN依赖性途径。

**Ternary complex modelling and surface plasmon resonance (SPR)**
分子动力学模拟显示，化合物2的刚性二炔连接子仅允许4种可行构象（共36种），而化合物3允许23种，表明结构刚性限制了BRD4-CRBN界面。SPR实验表明，化合物2和3均形成稳定的三元复合物（BRD4BD1:PROTAC:CRBN），具有正协同性，α值分别为3.1和31.1（化合物3协同性更强），且解离半衰期t_1/2分别为120 s和81 s。

**Label-free visualisation of via SRS microscopy**
SRS成像在2212 cm^-1处检测到化合物2的二炔信号。1 μM和10 μM处理下，化合物2主要定位于内质网（与ER tracker共定位），且细胞内浓度富集50-200倍。弱核信号被确认与靶点结合相关，而非降解产物。在蛋白酶体抑制后，化合物2在核仁聚集物中检测到，提示其与BRD4和CRBN结合。

讨论部分总结：短刚性二炔连接子通过减少构象自由度提供了熵优势，有利于计算预测和理性设计。SRS成像揭示了PROTACs主要定位于内质网，且这一分布并非由连接子驱动（柔性连接子的阳性对照也分布于内质网）。定量SRS分析可评估药物膜通透性。研究结论翻译如下：
结论：PROTAC技术通过靶向难治蛋白为疾病治疗提供了有吸引力的途径，但连接子设计仍是挑战。本研究利用4原子线性刚性二炔连接子，生成了高效CRBN招募的BET蛋白降解剂（化合物2和3），其DC₅₀值低至35-36 nM，且通过UPS和CRBN依赖性途径降解BRD4。SPR和模拟证实了稳定三元复合物的形成，尤其化合物3表现出极高的正协同性（α=31.1）。这些是首个完全刚性线性连接子的PROTAC，其结构限制为计算预测提供了优势。SRS成像首次实现无标记实时可视化PROTACs在活细胞内的分布（低微摩尔浓度），主要定位于内质网，且细胞内富集显著。二炔连接子既可用于药物开发，又可作为成像工具，为理解细胞摄取机制、耐药性以及诊断应用提供了新途径。