### 论文解读：阿米洛利的RNA结合图谱——大规模轮廓分析与U–U错配识别的结构基础

#### 研究背景与科学问题

在化学生物学领域，能够通过互补氢键特异性识别DNA和RNA中特定核碱基的小分子是强大的研究工具。这类分子在核酸检测、分子胶水、微RNA成熟调控、靶向致病性重复扩增RNA以及构建核酸基架构中均有应用。阿米洛利（amiloride）是一种能够与尿嘧啶（U）形成假碱基对的小分子。既往研究表明，阿米洛利能识别并结合RNA双链中由C3间隔子创建的人工空腔内的未配对U残基，其衍生物对多种病毒RNA显示出广泛的结合活性。然而，阿米洛利在天然RNA结构中的结合行为在很大程度上仍是未知的。特别是，尽管它具有高亲和力识别U的潜力，但关于其RNA结合选择性的大规模评估，以及其与天然RNA靶点形成特征性三重氢键相互作用的直接实验证据此前尚未报道。为了系统地回答这些问题，研究人员需要一种能够分析配体-RNA相互作用的方法。此前的基础性工作已建立了从RNA基序文库中提取这些关系的统计框架，并引入了基于基序的筛选、定量富集分析以及全面的RNA结合选择性轮廓分析。在此基础上，研究人员开发了FOREST（folded RNA element profiling with structure library）平台，该平台利用包含内环、凸起、多环及其他非经典基序的结构多样化天然人类RNA序列库，进行基于Z分数（Z-score）的小分子-RNA相互作用大规模轮廓分析。该系统的优势在于能够超越先前富集方法所用的组合基序文库，实现对更广泛结构景观中结合偏好的无偏识别。该方法的实用性此前已通过G-clamp得到验证，G-clamp是一种能强烈识别鸟嘌呤（G）的胞嘧啶类似物。研究人员在前期工作中通过大规模结合轮廓分析发现，G-clamp并非与所有未配对的G残基杂乱结合，而是对特定结构环境中的特定未配对G展现出严格的偏好。通过综合筛选鉴定出这些高亲和力基序，为测定G-clamp-RNA复合物的高分辨率X射线晶体结构铺平了道路，从而提供了其结合模式的原子级信息。此外，这些数据还促进了荧光染料噻唑橙（TO）-G-clamp共轭物作为荧光指示剂置换（FID）分析中荧光探针的开发，进而有助于发现新的RNA结合分子。

在本研究中，研究人员应用FOREST平台系统地评估了阿米洛利的RNA结合特性。首先，研究人员设计并合成了用于FOREST分析的阿米洛利衍生物，同时保留了该分子的核心氢键作用面。然后通过荧光滴定实验验证了所得的RNA结合图谱，并使用表面等离子体共振（SPR）进一步检测了为FOREST分析引入的化学修饰的影响。最值得注意的是，研究人员鉴定出了阿米洛利与pre-miR-6074内环结构之间的高亲和力相互作用。最后，对阿米洛利-RNA复合物的X射线晶体学分析，据研究人员所知，首次提供了原子分辨率的证据，表明阿米洛利通过其特征性的三重氢键模式，识别天然RNA结构中U–U错配内的一个U残基。该研究论文发表在《RSC Advances》上。

#### 关键技术方法概述

为开展这项研究，研究人员采用了多种关键技术方法。首先，应用了基于结构文库的折叠RNA元件轮廓分析（FOREST）平台，该平台包含3000个来源于人类前体microRNA（pre-miRNAs）、病毒RNA和重复序列的结构化RNA基序，用于大规模筛选阿米洛利的RNA结合选择性，通过Z分数评估结合偏好。其次，通过荧光滴定实验测定表观解离常数（\(K_{D}^{app}\)），以验证FOREST筛选结果并定量结合亲和力。第三，利用表面等离子体共振（SPR）技术分析阿米洛利衍生物与RNA的相互作用，并评估连接基团修饰的影响。第四，采用RNase A和RNase T1足迹法鉴定阿米洛利在pre-miR-6074上的结合位点。最后，通过X射线晶体学解析阿米洛利-RNA复合物的高分辨率三维结构，揭示其原子水平的结合模式。所有晶体学数据已存入蛋白质数据库（PDB），编号为23JY、23JZ和23KA。

#### 研究结果介绍

**1. 阿米洛利衍生物的分子设计**

为确保在FOREST分析中能固定于磁珠，研究人员设计了两种带有叠氮修饰的阿米洛利衍生物：amiloride-guanidine-N₃（在胍基上引入连接基）和amiloride-alkyne-N₃（在吡嗪环上引入炔基修饰）。设计旨在保留阿米洛利核心的氢键供体-受体模式。通过菌株促进的叠氮-炔基环加成（SPAAC）反应将衍生物生物素化，并通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）和电喷雾电离高分辨质谱（ESI-HRMS）确认产物。

**2. 阿米洛利的RNA结合选择性**

通过FOREST分析，研究人员发现对于两种阿米洛利衍生物，高Z分数（>1.96）的序列主要富集了含有多个连续鸟嘌呤的RNA，表明阿米洛利衍生物偏好结合G-四链体（G4）RNA。此外，分析还揭示了含有U–U错配的RNA（如毒性重复RNA r(CUG)₁₆）在排名靠前的序列中富集。比较两种衍生物的Z分数，显示出强相关性（r=0.92），表明不同的连接基位置并未显著改变其RNA结合特性。荧光滴定实验证实，阿米洛利与G4 RNA（如r(UGGU)₆，\(K_{D}^{app}\)=2.5 μM）和r(CUG)₁₆（\(K_{D}^{app}\)=4.1 μM）表现出中等亲和力。最引人注目的是，在FOREST中排名并非最高的pre-miR-6074，在溶液中与阿米洛利结合表现出极高的亲和力（\(K_{D}^{app}\)=0.31 μM），比r(CUG)₁₆强10倍以上。相比之下，低排名RNA的结合亲和力很弱（\(K_{D}^{app}\)>30 μM），验证了FOREST结果的有效性。值得注意的是，某些低排名RNA也含有U残基或U–U错配，但仅观察到弱结合，表明阿米洛利的结合具有结构特异性。

**3. 连接基对结合pre-miR-6074的影响**

利用SPR分析，研究人员评估了连接基修饰对阿米洛利与pre-miR-6074相互作用的影响。结果显示，亲和力顺序为阿米洛利（\(K_{D}^{app}\)=2.3 μM）> amiloride-guanidine-N₃（\(K_{D}^{app}\)=4.4 μM）> amiloride-alkyne-N₃（\(K_{D}^{app}\)=17 μM），表明吡嗪环上的炔基修饰对结合不利。此外，缺少胍基的阿米洛利类似物结合很弱（\(K_{D}^{app}\)>50 μM），证实了阳离子胍基在结合中通过静电相互作用起关键作用。不同实验方法所得\(K_{D}^{app}\)值的差异可能源于溶液自由态与表面固定态RNA环境的差异。

**4. 阿米洛利在pre-miR-6074上结合位点的研究**

通过RNase A足迹实验，研究人员发现阿米洛利以浓度依赖的方式抑制了内环区域的切割，而对发夹环区域的切割无影响，表明阿米洛利的主要结合位点是pre-miR-6074的内环结构。RNase T1足迹实验也支持了这一结论。对pre-miR-6074突变体的荧光滴定进一步证实，内环中的U–U错配是结合所必需的（pre-miR-6074_UU_mut突变体无结合），而G–A错配可能起到了扩大容纳阿米洛利的空腔的作用（pre-miR-6074_GA_mut突变体亲和力降低）。熔解温度（T_m）分析表明，阿米洛利既不稳定也不去稳定pre-miR-6074的结构，这与先前对G-clamp的观察结果一致。

**5. 阿米洛利-RNA复合物的X射线晶体学分析**

基于上述发现，研究人员设计了两种用于X射线晶体学研究的RNA：pre-miR-6074_XR和pre-miR-6074_XR_TLR。两者均提取了pre-miR-6074内环区域，并将其整合到便于结晶的模型序列中。晶体结构解析显示，pre-miR-6074_XR结构中未结合阿米洛利，但揭示了朝向U8氢键边缘的空腔。而pre-miR-6074_XR_TLR结构明确显示了结合的阿米洛利。电子密度图清晰地定位了配体，其几何位置与U32的O2、N3的亚氨基氢和O4形成三个氢键相一致。此外，阿米洛利的胍基可能与相邻U3的2′-羟基形成氢键，并且阿米洛利与侧翼的U3、G5和A33残基之间存在堆积相互作用。阿米洛利的高度平面构象得益于其分子内氢键。所有结构中都观察到内环相邻的U残基采取C2′-内型（C2′-endo）构象，这种非经典的核糖构象可能预组织了结合口袋，有利于阿米洛利的结合。

#### 总结与结论

本研究对阿米洛利的RNA结合特性进行了全面的评估。通过利用FOREST平台，成功鉴定了与阿米洛利特异性相互作用的天然RNA结构基序，包括G4 RNA和在内环中含有U–U错配的RNA。研究提供了关键的原子分辨率证据，详细阐述了一个典型的药物样骨架如何选择性地靶向特定的U–U错配。对阿米洛利/pre-miR-6074_XR_TLR复合物的X射线晶体学分析揭示，这种高亲和力结合是通过与U形成特征性的三重氢键模式，并结合堆积相互作用及结合位点处独特的C2′-内型核糖构象实现的。

这些整合的生物化学和结构数据揭示了阿米洛利与不同RNA靶点相互作用时清晰的机制区别：其平面的阳离子骨架通过静电和堆积作用赋予对高度结构化RNA（如G-四链体）的一般亲和力；而对于U–U错配口袋的靶标选择性，则严格由额外的精确氢键网络决定。将这种高度特异的氢键驱动识别与通用的静电亲和力区分开来，为基于经典药物骨架设计高选择性RNA靶向治疗药物提供了关键的结构基础。

此外，原子分辨率结构为基于结构的分子设计提供了精确框架。结构分析显示，阿米洛利的胍基位于RNA的浅而相对开放的浅沟中，这从结构上解释了为何在此位点进行修饰（如在SPR分析中观察到的）具有良好的耐受性。同时，这提示胍基是连接额外结合基团或庞大荧光团的理想位点，因为其在浅沟中的定位允许进行化学修饰而不破坏U识别所必需的氢键作用面。基于这些发现，研究人员正在进一步优化该骨架，并将其应用扩展到更广泛的功能性RNA元件，以开发RNA靶向治疗药物和先进的分析平台。

**研究结论翻译：** 总之，本研究对阿米洛利的RNA结合特性进行了全面评估。通过利用FOREST平台，研究人员成功鉴定了与阿米洛利特异性相互作用的天然RNA结构基序，包括G4 RNA和某些在其内环中含有U–U错配的RNA。X射线晶体学分析阿米洛利/pre-miR-6074_XR_TLR复合物揭示，这种高亲和力结合是通过与U形成特征性的三重氢键模式，辅以堆积相互作用和结合位点处独特的C2′-内型核糖构象实现的。重要的是，这些整合的生物化学和结构数据揭示了阿米洛利作用于不同RNA靶点时所采用的清晰机制区别，为设计基于经典药物骨架的高选择性RNA靶向疗法提供了关键的结构基础。基于这些发现，研究人员正在进一步优化该骨架并扩展其应用。