新型吡唑/噻唑查尔酮杂合物的分子设计、合成及机制评价：兼具微管蛋白聚合与COX-2双重抑制活性的强效抗增殖候选药物

《RSC Advances》：Design, synthesis, and mechanistic evaluation of novel pyrazole/thiazole chalcone hybrids as dual tubulin polymerization and COX-2 inhibitors with potent antiproliferative activity

　　

研究人员设计、合成并评价了一系列新型吡唑/噻唑查尔酮杂合物（），旨在开发兼具微管蛋白（tubulin）聚合抑制与环氧合酶-2（COX-2）抑制双重活性的抗癌候选药物。所合成化合物经抗增殖活性筛选，检测对象为MDA-MB-231、HCA-7及A549三种癌细胞系。多个衍生物表现出良好的活性，其中化合物对MDA-MB-231细胞最为强效（IC₅₀ = 1.96 ± 0.10 μM）；而化合物则展现出最为均衡的活性谱，对HCA-7、MDA-MB-231及A549细胞的IC₅₀值分别为2.18 ± 0.11、2.92 ± 0.15及4.86 ± 0.25 μM。机制研究揭示该系列化合物的抗癌活性通过双重机制介导：抑制微管蛋白聚合及选择性抑制COX-2。具体而言，化合物抑制微管蛋白聚合的IC₅₀为4.21 ± 0.25 μM，并表现出强效的COX-2抑制活性（IC₅₀ = 0.10 ± 0.01 μM），同时对COX-1具有高选择性（IC₅₀ = 10.92 ± 0.78 μM；选择性指数SI = 109.20）。进一步的HCA-7细胞研究显示，显著上调Bax水平至438.64 ± 15.72 pg mL^?1，降低Bcl-2至6.74 ± 0.19 pg mL^?1，同时显著升高caspase-3及caspase-9水平至496.80 ± 14.90 pg mL^?1和47.86 ± 1.18 ng mL^?1。此外，强效抑制前列腺素E2（PGE-2）产生至0.56 ± 0.04 ng mL^?1，对应89.2%的抑制率，并诱导G2/M期细胞周期阻滞。该化合物在伤口愈合实验中亦显示出良好的抗迁移活性、有利的微粒体稳定性及可接受的计算机模拟ADMET（吸收、分布、代谢、排泄及毒性）性质。分子对接研究进一步支持其在微管蛋白及COX-2活性位点中的有利结合模式。综上所述，这些发现确立了化合物作为有前景的双重微管蛋白/COX-2靶向抗癌候选药物的地位。

癌症仍是全球主要死因之一，尽管手术、放疗及系统治疗已取得显著进展，但其致死性持续对治疗构成重大负担。肿瘤的致命性不仅源于不受控制的增殖，还涉及侵袭、转移以及对治疗药物渐进性获得耐药。世界卫生组织数据显示，2020年癌症导致近千万人死亡，约三分之一的癌症死亡与烟草使用、饮酒、肥胖、不健康饮食及缺乏身体活动等可改变危险因素相关。这些因素持续推动着能够同时干预多条癌症相关通路的机制创新性小分子药物的研发。

在已验证的抗癌策略中，干扰微管动力学是药物化学中最成功的途径之一。微管是由α/β-微管蛋白异二聚体构成的动态聚合物，对细胞骨架构建、胞内运输及有丝分裂过程中的染色体分离至关重要。抑制微管蛋白聚合的试剂可抑制纺锤体形成，使细胞阻滞于G2/M期，并最终促进凋亡性死亡。在这一类药物中，靶向秋水仙碱结合位点的配体尤为引人关注，因其能阻止微管蛋白 adopting 微管组装所需构象；康普他汀A-4（CA-4）是这类原型药物的代表。然而，CA-4的临床应用受其顺式-二苯乙烯体系固有限制，特别是活性几何构型易丧失及相关药学缺陷，这促使研究人员开发结构受限的类似物及杂环替代物。

在此背景下，噻唑和查尔酮均已成为微管蛋白聚合抑制剂设计中的高价值骨架。含噻唑结构的支架在抗癌药物发现中具有确立地位，可作为适合秋水仙碱位点结合的刚性杂芳环框架。同样，查尔酮提供了能够占据微管蛋白口袋疏水区域并促进抗增殖活性的 privileged 芳基-烯酮支架。文献报道的[2,1-b]噻唑-查尔酮轭合物I展现了广泛的细胞毒性及微管破坏、G2/M期阻滞和凋亡诱导作用；苯并[d]咪唑[2,1-b]噻唑-查尔酮杂合物也表现出有效的微管组装抑制作用。此外，噻唑-查尔酮化合物凸显了该杂合框架作为微管靶向药效团的固有可能性，而化合物和则通过将微管干扰与碳酸酐酶IX抑制相结合进一步拓展了这一策略。双噻唑查尔酮在MCF-7细胞中表现出显著的抗微管活性，伴有明确的细胞周期阻滞和凋亡效应；噻唑-2-乙酰胺衍生物也显示出强效的微管相关抗增殖活性。

第二条与恶性进展高度相关的通路是环氧合酶通路，特别是COX-2。COX-1为组成性表达，参与胃黏膜保护和血小板生理等稳态功能；而COX-2为诱导性同工酶，在炎症及多种肿瘤中显著上调。除炎症作用外，COX-2通过促进前列腺素依赖性增殖、血管生成、迁移、侵袭、免疫逃逸及抗凋亡等机制参与癌症的多项标志性特征。这解释了选择性COX-2抑制剂作为抗癌药物持续的研发兴趣。经典coxib类药物如塞来昔布、罗非昔布、伐地昔布和依托考昔旨在利用COX-1与COX-2之间的结构差异，特别是COX-2较大的二级侧袋；然而安全性问题限制了部分该类药物的使用。尽管如此，COX-2/PGE2轴仍是杂合抗癌设计的吸引性靶点。

吡唑环被认为是药物化学中的 privileged 骨架，因其广泛且文献记载完善的药理活性谱，包括镇痛、抗炎、抗癌、抗菌及中枢神经系统效应。特别地，基于吡唑的化合物在非甾体抗炎药化学中具有确立地位，并被广泛用于COX-2靶向药物的设计。多种上市非甾体抗炎药相关药物含有吡唑核心，如塞来昔布、替泊沙林、氯那唑酸和双苯胺唑等。多种吡唑类选择性COX-2抑制剂的报道进一步凸显了该骨架的重要性。

基于上述背景，研究人员开展了本项研究，旨在将微管蛋白聚合抑制与COX-2靶向整合于单一杂合分子中。研究设计遵循CA-4启发的秋水仙碱位点抑制剂经典的环A-连接链-环B组织模式：环A为噻唑-查尔酮片段，作为扩展的疏水药效团以占据秋水仙碱结合口袋的疏水区域，同时作为CA-4不稳定顺式-二苯乙烯体系的构象受限替代物；连接链采用硫代乙酰胺间隔基；环B为1,3-二苯基吡唑单元，作为预期能在秋水仙碱结合位点相邻区域建立有利疏水相互作用的杂芳环部分，同时也在同一框架中提供COX-2相关的结构元素。

研究人员首先通过化学合成获得目标化合物系列，继而系统评价了其生物活性。在抗增殖活性方面，所合成的杂合物对MDA-MB-231（三阴性乳腺癌）、HCA-7（结肠癌）和A549（肺癌）三种人癌细胞系进行了筛选，以多柔比星和康普他汀A-4为参照化合物。结果表明，母体化合物活性最低，而所有取代类似物均较母体有所改善，证实两个芳香位置的修饰均可增强抗癌活性。化合物（R1 = Br, R2 = OCH3）为系列中总体最强效化合物，对MDA-MB-231、HCA-7和A549细胞的IC₅₀值分别为1.96 ± 0.10、2.57 ± 0.13和4.18 ± 0.21 μM；化合物（R1 = Cl, R2 = OCH3）则为第二强效的类似物，对三种细胞的IC₅₀值分别为2.92 ± 0.15、2.18 ± 0.11和4.86 ± 0.25 μM，且对HCA-7细胞的活性超过多柔比星。

在正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的细胞毒性评价显示，目标化合物对正常细胞的毒性显著低于癌细胞，IC₅₀值范围为12.76 ± 0.46 μM至24.24 ± 1.06 μM，而多柔比星对MCF-10A细胞的IC₅₀仅为2.80 ± 0.25 μM，显示相当的正常细胞毒性。化合物和不仅表现出最高的抗增殖效价，同时也具有最优的选择性谱：对三种癌细胞系的SI值分别达6.51/4.96/3.05和5.11/6.84/3.07，均超过多柔比星，且在MDA-MB-231和A549细胞中超过康普他汀A-4。

在体外微管蛋白聚合抑制实验中，杂合物表现出明确的抑制活性，IC₅₀值范围为3.97–12.18 μM，CA-4为3.84 ± 0.28 μM。化合物、、和最为活跃，IC₅₀值分别为3.97 ± 0.24、4.21 ± 0.25、4.43 ± 0.27和4.96 ± 0.31 μM。取代模式分析表明，R2位甲氧基取代产生最有利的效果，R2 = OCH3的化合物构成整体最活跃的亚组；当R2保持未取代时，卤素和甲氧基取代均较甲基和氢取代更优。微管蛋白聚合抑制结果与细胞抗增殖数据良好吻合，支持微管蛋白聚合抑制是这些杂合物细胞毒性活性的主要贡献因素。

体外COX抑制实验评估了五个最有前景的化合物。所有测试杂合物均表现出对COX-2的优先抑制，COX-2 IC₅₀值处于亚微摩尔范围（0.10–0.86 μM），选择性指数为9.79–109.20。化合物表现出最为显著的COX-2抑制谱，IC₅₀为0.10 ± 0.01 μM，与塞来昔布（0.08 ± 0.01 μM）相当，仅低1.25倍；其COX-2选择性指数达109.20，约为塞来昔布SI（178.00）的61%。这一发现尤为显著，因为该化合物为非coxib骨架，缺乏通常认为对高COX-2选择性至关重要的磺酰胺或甲磺酰基药效团。

在HCA-7细胞中的进一步机制研究表明，化合物显著改变细胞周期分布：G0/G1期细胞从59.06%降至32.81%，S期从32.31%降至22.04%，而G2/M期从8.63%显著增加至45.15%，表明诱导G2/M期细胞周期阻滞。Annexin V-FITC/PI双染实验证实，的生长抑制效应主要通过诱导凋亡性细胞死亡介导：早期和晚期凋亡群体分别增至9.15%和28.68%，而坏死群体仅4.39%。

在蛋白表达层面，使Bax蛋白水平显著增加至438.64 ± 15.72 pg mL^?1（5.63倍上调），同时Bcl-2降至6.74 ± 0.19 pg mL^?1（0.332倍），提示通过线粒体途径诱导凋亡。Caspase-3水平升至496.80 ± 14.90 pg mL^?1（8.54倍），caspase-9升至47.86 ± 1.18 ng mL^?1（9.08倍），确认有效激活内在线粒体凋亡途径。此外，以1.0 μM处理使PGE-2产生降至0.56 ± 0.04 ng mL^?1，对应89.2%的抑制率，与此前确立的选择性COX-2抑制谱一致。

细胞迁移实验显示，显著损害HCA-7细胞迁移能力：72小时后，伤口闭合率从对照组的97.04 ± 3.15%降至58.52 ± 1.88%。代谢稳定性方面，在人肝微粒体中表现出浓度依赖性改善的稳定性表型，较高底物浓度下半衰期延长、内在清除率降低，符合可能的酶饱和特征，处于可接受的类药范围内。

计算研究方面，分子对接揭示了支持双重活性的结构基础。在微管蛋白秋水仙碱结合位点（PDB ID: 4O2B）中，预测结合亲和力为?9.6 kcal mol^?1，优于秋水仙碱的?8.4 kcal mol^?1；吡唑环与Leu255形成π–σ相互作用，与Leu242形成π–烷基相互作用，酰胺NH与Val238形成经典氢键。在COX-2活性位点（PDB ID: 1CX2）中，预测结合亲和力为?11.0 kcal mol^?1，优于共晶配体SC-558的?10.3 kcal mol^?1；酰胺羰基与Tyr355形成经典氢键，甲氧基取代基通过疏水相互作用增强结合，氯原子也与His95及Pro514形成额外疏水接触。ADMETlab 3.0预测显示良好的肠道吸收特性、可接受的分布容积和清除率，且无PAINS、BMS或螯合警示。

研究讨论部分，研究人员总结了该系列噻唑-查尔酮/吡唑杂合物的设计策略与生物学评价结果。双重靶向微管蛋白聚合与COX-2的合理性得到充分论证：微管蛋白抑制破坏有丝分裂纺锤体形成促进凋亡，而COX-2抑制预期可抑制前列腺素驱动的肿瘤生长、血管生成、侵袭和抗凋亡信号。这一概念得到临床前和临床证据支持，包括塞来昔布联合紫杉烷方案的研究。分子杂化策略的可行性也已被rofecoxib/康普他汀杂合物KSS19等先例所证实。

在具体化合物中，和成为系列中最活跃的成员。其中展现出最为均衡的生物学谱：强效的微管蛋白聚合抑制、强而高度选择性的COX-2抑制、显著的PGE-2产生抑制、G2/M期细胞周期阻滞诱导、以及由Bax上调、Bcl-2下调和caspase-3/9激活介导的显著凋亡效应。此外，显著抑制HCA-7细胞迁移，进一步扩展了其抗癌特性谱。这些实验结果与分子对接结果一致，后者证明在微管蛋白秋水仙碱结合位点和COX-2活性位点中均具有有利的占据模式。ADMET预测和人肝微粒体稳定性研究同时提示了可接受的类药性和代谢特征。

研究结论部分指出：新型噻唑-查尔酮/吡唑杂合物（）被成功设计、合成和生物学评价为潜在的双重作用抗癌药物，靶向微管蛋白聚合和COX-2。多个衍生物对MDA-MB-231、HCA-7和A549癌细胞系表现出有前景的抗增殖活性，且对正常MCF-10A细胞的选择性有所改善。化合物和为系列中最活跃的成员。其中，化合物表现出最均衡的生物谱，包括强效的微管蛋白聚合抑制、强且选择性的COX-2抑制、PGE-2产生的显著抑制、G2/M期细胞周期阻滞的诱导、以及与Bax上调、Bcl-2下调及caspase-3和caspase-9激活相关的显著凋亡效应。此外，显著抑制HCA-7细胞迁移，进一步支持其抗癌潜力。这些实验发现与分子对接结果一致，后者证明在微管蛋白和COX-2的活性位点中均具有有利的结合。同时，ADMET预测和人肝微粒体稳定性研究表明其具有可接受的类药性和代谢特征。总体而言，化合物代表了作为多靶点抗癌药物进一步优化的有前景的先导化合物。

本研究发表于《RSC Advances》。研究采用的主要关键技术方法包括：基于分子杂交的理性药物设计、多步有机合成化学（包括 regioselective 氯化、Claisen–Schmidt缩合、环缩合及S-烷基化等反应）、MTT法细胞抗增殖与细胞毒性评价、荧光动力学法微管蛋白聚合抑制实验、COX-1/COX-2酶抑制实验（Cayman试剂盒）、流式细胞术进行细胞周期与凋亡分析（PI单染及Annexin V-FITC/PI双染）、ELISA法定量检测Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9及PGE-2蛋白水平、CytoSelect?伤口愈合实验评估细胞迁移、人肝微粒体代谢稳定性研究（NADPH支持氧化条件）、分子对接研究（AutoDock Vina，针对tubulin PDB 4O2B及COX-2 PDB 1CX2），以及ADMETlab 3.0平台的计算机模拟药代动力学与毒性预测。