使用嵌入修饰纤维素聚合物薄膜中的Tb-蒽-9-甲醛复合物用于前列腺癌患者血清中tPSA早期检测的新型生物传感器

《RSC Advances》：New biosensor for the early detection of tPSA in the serum of prostate cancer patients using a Tb-anthracene-9-carboxaldehyde complex embedded in a modified cellulose polymer thin film

　　

本研究报告了一种新型光学生物传感器的开发与验证，该传感器利用嵌入环氧功能化羧甲基纤维素（CMC）聚合物薄膜中的铽-蒽-9-甲醛（Tb-A9C）复合物，用于前列腺癌患者血清样本中总前列腺特异性抗原（tPSA）的早期检测。研究人员通过考察溶剂效应和金属配体摩尔比系统优化了传感器，确定二甲亚砜（DMSO）和1:1（Tb:A9C）化学计量比为最优条件，在545 nm处获得最大发光强度。通过扫描电子显微镜（SEM）进行的表面表征证实了逐层组装成功，显示从开裂的聚合物表面转变为光滑的传感器嵌入薄膜，随后出现树枝状抗体固定模式；而傅里叶变换红外光谱（FTIR）通过特征官能团指纹验证了每个制备阶段。在通过戊二醛交联功能化抗PSA单克隆抗体后，该薄膜传感器在tPSA结合时表现出浓度依赖的发光猝灭，能够在0.025–0.30 ng mL^-1的线性范围内进行定量检测，检测限极低为0.0159 ng mL^-1，并具有优异的决定系数（R² = 0.995）。该生物传感器在使用前列腺癌患者临床血清样本的日内和日间评估中表现出出色的准确度和精密度，与标准ELISA方法高度一致（灵敏度：100%，特异性：100%）。分子对接和100纳秒分子动力学模拟揭示了Tb-A9C复合物在PSA口袋C3内的稳定结合（ΔG = –7.5 kcal mol^-1），持续的氢键网络和最小的结构波动证实了特异且稳定的复合物形成。铽复合物的优异光物理性质，包括大斯托克斯位移、可实现时间门控检测的长发光寿命，以及稳定的CMC聚合物基体和结合稳定性的计算验证，使这种Tb-A9C薄膜生物传感器成为一种简单、灵敏、稳定且经济有效的替代方法，用于前列腺癌的早期检测和临床监测。

**论文解读**

**研究背景与问题**
癌症是全球过早死亡的主要原因，其中前列腺癌在男性中是第二大常见癌症，2020年全球新发病例约140万。在埃及，2020年登记4767例新发病例和2227例死亡。局限性前列腺癌的五年生存率接近100%，但转移后降至30%，因此早期准确检测至关重要。当前广泛使用的前列腺特异性抗原（PSA）检测存在假阳性问题，常导致不必要的活检；经直肠超声（TRUS）和多参数磁共振成像（mpMRI）灵敏度有限；而活检本身具有侵入性风险。现有方法如ELISA和质谱分析仪器复杂、耗时长，且难以在维持蛋白质天然状态下检测极低浓度标志物。因此，亟需开发快速、灵敏、便携的PSA检测技术。本研究旨在开发一种基于铽-蒽-9-甲醛（Tb-A9C）复合物嵌入环氧功能化羧甲基纤维素（CMC）聚合物薄膜的新型光学生物传感器，用于血清中总PSA（tPSA）的早期检测，并进行了系统优化、性能验证和计算模拟。该论文发表在《RSC Advances》。

**主要关键技术方法**
研究人员通过溶剂筛选（DMSO、DMF、ACN、EtOH）和金属配体摩尔比优化（1:1、1:2、1:3）确定了Tb-A9C复合物的最佳制备条件。采用扫描电子显微镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征薄膜的形貌和化学结构。通过戊二醛交联将抗PSA单克隆抗体固定到薄膜表面，构建免疫传感器。使用10份源自埃及开罗Al-Kasr El-Aini New Teaching Hospital和Ain Shams Specialized Hospital的前列腺癌患者血清样本进行临床验证，并与ELISA对比。通过分子对接（AutoDock Vina）和100纳秒分子动力学模拟（GROMACS）评估Tb-A9C复合物与PSA的结合机制和稳定性。

**研究结果**

**3.1 薄膜生物传感器平台表征**
- **3.1.1 扫描电子显微镜分析**：裸环氧功能化CMC薄膜呈现裂纹表面；嵌入Tb-A9C复合物后变为光滑连续薄膜；抗体固定后出现树枝状结构，证实了逐层组装成功。
- **3.1.2 FTIR分析**：Tb-A9C嵌入后出现蒽环特征峰（1400–1600 cm^-1和700–900 cm^-1）；抗体固定后出现酰胺I带（~1640–1650 cm^-1）和酰胺II带（~1540–1550 cm^-1），验证了化学修饰。

**3.2 Tb-A9C复合物表征**
- **3.2.1 溶剂效应**：DMSO中发光强度最高，依次为ACN > DMF > EtOH，归因于DMSO的高极性和稳定作用；乙醇因O-H振动猝灭最弱。
- **3.2.2 金属配体摩尔比**：1:1比例下545 nm处发光最强（23,322 a.u.），1:2和1:3比例分别降至10,534和8,334 a.u.，表明配体过量导致自猝灭。

**3.3 发光特性与传感机理**
- **3.3.1 发光寿命分析**：原始Tb-A9C薄膜寿命最长；加入PSA抗原或抗体后寿命缩短；完整免疫复合物（抗体+抗原）寿命最短，证实抗原结合增加了非辐射衰变途径。
- **3.3.2 抗原依赖性发光猝灭**：随PSA浓度增加（0.025–0.30 ng mL^-1），所有特征发射峰（490、544、587、620 nm）强度系统性降低，但峰形和峰位不变，表明猝灭机制不破坏Tb³⁺配位环境。
- **3.3.3 完整免疫传感器的紫外吸收谱**：逐层组装后，吸收光谱呈叠加特征，证实抗体和抗原成功结合。

**3.4 分析性能与方法验证**
- **3.4.1 校准曲线与检测限**：在0.025–0.30 ng mL^-1范围内呈现优异线性（R² = 0.995），检测限（LOD）为0.0159 ng mL^-1，定量限（LOQ）为0.048 ng mL^-1。
- **3.4.2 临床血清样本的准确度与精密度**：日内和日间相对误差（%RE）均小于0.16，相对标准偏差（%RSD）低于1%，与ELISA高度一致（Bland-Altman分析平均偏差0.032 ng mL^-1，Passing-Bablok回归斜率为1.009，Pearson相关系数r=0.9989）。
- **3.4.3 诊断性能指标**：灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）均为100%（基于10份样本）。

**3.5 分子对接与计算分析**
- **3.5.1 PSA结合口袋识别与表征**：盲对接发现5个潜在结合口袋，其中口袋C3（体积2704 ?³）结合亲和力最强（ΔG = –7.5 kcal mol^-1），通过氢键（S34、N202）和疏水相互作用稳定。
- **3.5.2 分子动力学模拟**：100纳秒模拟显示体系在30 ns后收敛，RMSD稳定在0.29–0.38 nm，回旋半径（Rg）稳定在2.69–2.75 nm，氢键数目动态维持0.24–0.33，关键残基（S34、G96、G97等）波动低，证明复合物稳定。

**3.6 发光猝灭机制**：抗原-抗体结合使PSA蛋白中的O–H、N–H、C–H振动模式与Tb³⁺激发态能量匹配，导致振动能量转移；同时光诱导电子转移（来自色氨酸和酪氨酸残基）也贡献了猝灭；Stern-Volmer分析结合寿命测量表明静态和动态猝灭混合机制，静态猝灭约占60–70%。

**总结与结论**
研究人员开发并验证了一种基于Tb-A9C复合物嵌入环氧功能化CMC薄膜的光学生物传感器，用于血清中tPSA的早期检测。通过溶剂和摩尔比优化、SEM/FTIR表征、临床样本验证、分子对接和分子动力学模拟，证明该传感器具有高灵敏度（LOD 0.0159 ng mL^-1）、良好线性、与ELISA等效的准确度和完美诊断性能。结论部分原文翻译如下：“本研究成功开发并验证了一种基于铽-蒽-9-甲醛（Tb-A9C）复合物嵌入环氧功能化羧甲基纤维素聚合物薄膜的新型光学生物传感器，用于前列腺癌患者血清样本中总前列腺特异性抗原（tPSA）的早期检测和定量。传感器组件的系统优化确定二甲亚砜（DMSO）为最佳溶剂，1:1的Tb与配体摩尔比为理想化学计量比，在特征545 nm发射波长下提供最大发光强度。使用扫描电子显微镜（SEM）的综合表征证实了生物传感器平台的逐层组装成功，显示Tb-A9C嵌入后表面光滑连续，抗体固定后出现独特树枝状结构，为传感器制备和生物功能化提供了明确视觉证据。傅里叶变换红外光谱（FTIR）通过识别特征振动指纹验证了每个制备步骤，确认了完整免疫传感器组件的结构完整性和化学组成。Tb-A9C薄膜生物传感器的分析性能表现出卓越灵敏度，检测限为0.0159 ng mL^-1，在临床相关浓度范围0.025–0.30 ng mL^-1内具有优异线性（R²=0.995）。使用前列腺癌患者血清样本的方法验证显示出色的日内和日间准确度和精密度，相对误差（%RE）值一致低于0.16，相对标准偏差（%RSD）值低于1%，证实了该方法用于常规临床应用的可靠性。该生物传感器在评估患者群体中表现出完美的诊断性能指标（100%灵敏度、100%特异性、100%阳性预测值和100%阴性预测值），证明了其作为明确诊断工具的潜力。分子对接研究确定PSA的口袋C3为Tb-A9C复合物的最有利结合位点，预测结合亲和力为–7.5 kcal mol^-1，氢键和疏水相互作用的协同网络为高亲和力识别提供了结构基础。随后的100纳秒分子动力学模拟证实了Tb-A9C–PSA复合物的稳定性和持久性，蛋白-配体体系在整个模拟过程中维持稳定的RMSD、回旋半径和氢键模式，关键相互作用残基波动极小。所开发传感器的优越性能归因于铽复合物的独特光物理性质，包括大斯托克斯位移、可实现时间门控检测的长发光寿命以及通过蒽配体的高效天线效应敏化。将Tb-A9C复合物嵌入羧甲基纤维素聚合物薄膜提供了一个坚固、生物相容的平台，既保持了探针的发光特性，又实现了稳定的抗体固定和可重现的分析物结合。与传统诊断方法如ELISA相比，Tb-A9C薄膜生物传感器具有显著优势，包括操作更简单、响应快速、样品体积需求减少以及消除了多个处理步骤，同时保持了相同或更优的分析性能。该平台的卓越稳定性、重现性和灵敏度使其成为即时检测和资源有限环境中一种有前景的替代方案。”