SPR-生物传感器用于牛结核菌素中蛋白质的表征

《Sensing and Bio-Sensing Research》：SPR-biosensor for the characterisation of proteins in bovine tuberculins

　　

基于动物（Animal-based）的牛纯化蛋白衍生物（PPD）结核菌素的效力测定费力、难以重复且存在伦理挑战。在此，研究人员报告了一种无标记表面等离子体共振（SPR）生物传感器，用于牛PPD结核菌素中免疫优势蛋白的定量和定性分析，作为向体外（in vitro）质量控制迈出的一步。基于先前的蛋白质组学数据，选择CFP10、MPB83和MPB70抗原作为代表性标志物。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹分析表征相应的单克隆抗体，以分别显示其与天然和变性抗原的结合。使用SPR分析结合动力学。结果显示了高特异性和纳摩尔级亲和力，检测限分别为CFP10 10.5 nM、MPB83 14.4 nM和MPB70 6.5 nM。建立并优化了基于捕获的SPR测定法，用于复杂的PPD结核菌素基质，利用透析和非特异性结合（NSB）还原剂来消除基质效应。该SPR生物传感器能够在世界卫生组织（WHO）国际标准和商业PPD结核菌素中实现所有三种抗原的可重复、浓度依赖性检测。加标回收实验显示MPB83和MPB70完全回收，而CFP10的回收率降低。除了蛋白质定量外，动力学结合谱还提供了对PPD结核菌素中抗原完整性和聚集状态的见解。总体而言，本研究证明了SPR生物传感用于PPD结核菌素表征和定量的适用性，并为基于一致性、无动物的质量控制（consistency-based, animal-free quality control）提供了一个有前景的平台。

牛结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium，M.）牛型（M. bovis）或山羊型（M. caprae）引起的人畜共患严重传染病，对公共卫生和经济造成重大负担。体内诊断依赖于纯化蛋白衍生物（Purified Protein Derivative，PPD）结核菌素，其效力测定目前采用致敏豚鼠体内试验，该过程耗时、重复性差且涉及伦理困境。基于先前蛋白质组学分析鉴定的35种候选指示蛋白，研究人员选择CFP10、MPB83和MPB70三种免疫优势蛋白作为原理验证标志物，旨在开发一种基于体外一致性（consistency approach）的质量控制替代方法，以最终替代动物体内效力试验。该研究在《Sensing and Bio-Sensing Research》发表，通过开发一种无标记表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）生物传感器，实现了对牛PPD结核菌素中关键抗原的定性与定量分析，证明了SPR在复杂生物制品表征中的适用性，为建立无动物、基于一致性的质量控制平台提供了有力工具。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法（受试剂和具体操作步骤忽略限制）：首先，通过间接酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）和免疫印迹（Western Blot）分析初步验证所选单克隆抗体（针对CFP10、MPB83和MPB70）的特异性与目标结合能力；其次，利用表面等离子体共振（SPR）技术（Biacore T200仪器，CM5芯片）进行抗体捕获、结合动力学分析及抗原定量，抗体通过胺偶联固定的抗小鼠IgG捕获；再次，针对复杂PPD基质，采用透析（2 kDa截留）和添加非特异性结合（Non-Specific Binding，NSB）还原剂进行样品前处理以消除基质效应。样本来源方面，重组蛋白购自Lionex公司，PPD结核菌素包括WHO国际标准品（PPD WHO BOV，来自NIBSC）和商业制造商批次（PPD M）。

研究结果部分包括两个主要发现：

3.1 所选单克隆抗体的表征（Characterisation of selected monoclonal antibodies）：通过Western blot分析，所有抗体均能识别对应的重组变性抗原，无交叉反应，但观察到分子量异常，如CFP10在PPD中呈现高分子量条带，MPB83重组蛋白出现多聚体条带（二聚体、三聚体等）。间接ELISA显示抗体对天然抗原具有浓度依赖的特异性结合，计算EC₅₀值（αCFP10: 15.0 nM，αMPB83: 4.4 nM，αMPB70: 14.9 nM）。SPR动力学分析采用多循环捕获法，所有抗体呈现1:1结合模型，亲和常数（K_D）均在纳摩尔范围（αCFP10: 120 nM，αMPB83: 10 nM，αMPB70: 11 nM），其中αCFP10因更快解离速率（k_d = 3.29×10^-2 s^-1）而亲和力较低。SPR结合响应信号显示MPB83的最大响应值（约95 rRU）显著高于基于单体分子量预期的响应（约25 rRU），证实了MPB83重组蛋白的多聚体或聚集状态，与Western blot结果一致。

3.2 使用SPR定量结核菌素特异性蛋白（Quantification of tuberculin-specific proteins using SPR）：通过透析和添加NSB还原剂，有效消除了未经处理PPD样品在CM5芯片上的非特异性结合，实现了稳定的SPR检测。校准曲线显示所有三种重组蛋白在PPD矩阵中均具有浓度依赖性响应，且具有良好的日间和芯片间重现性。测定检测限（Limit of Detection，LOD）分别为CFP10: 10.5 nM、MPB83: 14.4 nM、MPB70: 6.5 nM。加标回收实验显示，在1:64和1:512稀释的PPD中，MPB83（105.2%-116.0%）和MPB70（102.7%-104.5%）几乎完全回收，而CFP10在低稀释度下回收率仅37.5%，高稀释度下为70.5%，表明基质对CFP10存在干扰。基于校准曲线，对PPD WHO BOV和PPD M中的抗原含量进行定量：PPD WHO BOV中CFP10约为11.1-8.4 μM（变异24%），MPB70约0.3 μM（变异12%），MPB83约0.06 μM（变异7%）；PPD M中各抗原含量更高且重现性更好（CFP10变异5%，MPB70变异11%，MPB83变异1%）。同时，SPR分析未观察到交叉反应性，且传感器表面在90个捕获-再生循环后基线保持稳定，显示了方法的鲁棒性。

研究总结讨论部分指出，SPR不仅提供了抗原定量能力，还通过动力学结合谱提供了关于抗原完整性、聚集状态及批次一致性（batch consistency）的额外“指纹”信息，这些信息是ELISA或免疫印迹等单点测定法无法提供的。特别地，αCFP10因快速解离产生的独特动力学特征可用于确认CFP10的同一性；MPB83的多聚体状态导致了解离曲线中的亲和力效应（avidity effects），可作为批次质量的指标。尽管SPR灵敏度对PPD分析足够，但存在标准曲线基于单体重组蛋白可能对聚集抗原定量产生偏差的局限性，特别是CFP10在PPD中的聚集形式导致回收率低下。此外，透析步骤难以标准化，未来可替换为脱盐柱或尺寸排阻色谱。研究人员建议未来采用参考结核菌素标准品（如WHO PPD）进行校准，以提升准确性并实现相对效力分析。本研究的最终结论部分翻译为：本文所展示的基于SPR的结核菌素生物传感器，已可作为评估实验批次一致性的宝贵工具，并提供关于制备品中结核菌素抗原同一性、稳定性和结构完整性的额外信息，与当前基于动物的检测方法相比，提供了一种更快速且更符合伦理的替代方案。