一种整合FRET和类纳米酶催化活性的双读出适配体传感器用于检测副溶血性弧菌

《Sensing and Bio-Sensing Research》：A dual-readout aptasensor integrating FRET and nanozyme-like catalytic activity for detection of Vibrio parahaemolyticus

　　

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种与海产品污染相关的主要食源性病原体，对公共健康构成严重威胁，凸显了开发快速、灵敏且可靠检测方法的必要性。在本研究中，研究人员开发了一种基于碳量子点（CQDs）与rGO–NH₂/Fe₃O₄/AuNPs纳米复合材料集成的双模式荧光和比色生物传感平台，用于副溶血性弧菌的灵敏检测。所提出的传感机制依赖于荧光共振能量转移（FRET）和催化信号放大。在无靶标时，CQDs的荧光因与纳米复合材料平台的FRET相互作用而被猝灭。当加入副溶血性弧菌后，特异性相互作用诱导荧光适配体/CQDs从纳米复合材料表面释放，导致显著的荧光恢复。同时，靶标的存在增强了AuNPs对3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化的催化活性，产生明显的比色响应。荧光强度与细菌浓度呈强线性关系，检测限（LOD）低至3.5 CFU/mL，表明具有优异的灵敏度和可重复性。比色模式也表现出良好的线性关系，LOD为6 CFU/mL，能够实现快速可视化检测。双模式系统将荧光检测的高灵敏度与比色分析的简便性和实用性相结合。总体而言，该策略为副溶血性弧菌检测提供了一个稳健、灵敏且通用的平台，在食品安全监测和环境分析中具有广阔的应用前景。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种与海产品污染相关的主要食源性病原体，对公共健康构成严重威胁。现有检测方法如培养法、聚合酶链式反应和免疫学方法虽准确，但耗时、需复杂仪器，不适用于现场分析。因此，开发简单、快速、高灵敏的传感平台迫在眉睫。本研究基于碳量子点（CQDs）与rGO–NH₂/Fe₃O₄/AuNPs纳米复合材料，构建了一种双模式荧光和比色生物传感平台，用于副溶血性弧菌的灵敏检测。该平台利用荧光共振能量转移（FRET）抑制和纳米酶类催化活性，实现双读出信号。研究人员通过优化各组分浓度和反应时间，在荧光模式和比色模式下均获得良好线性关系和低检测限（荧光模式LOD为3.5 CFU/mL，比色模式为6 CFU/mL）。实际海水样品加标回收率为95.83%–102.8%，选择性实验显示对非靶菌干扰极小。论文发表在《Sensing and Bio-Sensing Research》。这一策略为食品安全监测和环境分析提供了高效、实用的工具。

该研究采用的关键技术方法主要包括：1）以副溶血性弧菌生物质为前体，通过水热法合成碳量子点（CQDs），利用天然杂原子增强荧光性能；2）通过Hummers法制备氧化石墨烯（GO），再经还原得到还原氧化石墨烯（rGO），并用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化；3）采用化学共沉淀法合成Fe₃O₄纳米粒子，柠檬酸钠还原法合成金纳米颗粒（AuNPs）；4）将rGO–NH₂、Fe₃O₄和AuNPs逐层组装成三元纳米复合材料；5）利用EDC/NHS化学将副溶血性弧菌特异性适配体共价偶联至CQDs表面；6）构建FRET猝灭和纳米酶催化双模式检测体系，优化了纳米复合物用量、适配体浓度、TMB浓度和反应时间。样本来源：副溶血性弧菌ATCC17802购自伊朗国家遗传与生物资源中心（IBRC），实际样品为海水样本。

**3.1 Applied strategy（应用策略）**
研究人员设计了一种基于FRET和纳米酶催化活性的双模式传感策略。CQDs–适配体探针吸附于rGO–NH₂/Fe₃O₄/AuNPs纳米复合材料表面，因光谱重叠（CQDs发射峰与复合材料吸收峰重叠）发生FRET，导致CQDs荧光被猝灭。加入副溶血性弧菌后，适配体与靶标特异性结合并释放CQDs，荧光恢复；同时，适配体脱离释放纳米复合材料的催化活性位点，增强其类过氧化物酶活性，催化TMB氧化产生比色信号。通过SEM、TEM、XRD和EDS表征证实了复合材料成功合成，具有高表面积和均匀分散的纳米颗粒。

**3.2 Characterization of synthesized nanostructures（合成纳米结构的表征）**
SEM和TEM图像显示rGO呈褶皱层状结构，Fe₃O₄和AuNPs均匀分散在rGO表面，无明显聚集。EDX光谱检测到C、O、N（氨基功能化）、Fe和Au元素，XRD图谱显示rGO（002）、Fe₃O₄（220、311、511）和Au（111、200、220）的特征衍射峰，确认了三元纳米复合物的成功合成和晶体结构完整性。

**3.3 Optimization（优化）**
通过系列实验优化了传感参数：当纳米复合物用量为30 μg时荧光猝灭效果最佳；CQDs–适配体浓度为0.15 μM时荧光发射峰最高；TMB最佳浓度为2.5 mM，反应时间为30 min。这些条件保证了最佳信号响应。

**3.4 Assay performance（检测性能）**
在荧光模式下，随着副溶血性弧菌浓度（10¹–10⁶ CFU/mL）增加，荧光强度逐渐上升，线性关系良好（R2=0.9864），LOD为3.5 CFU/mL。在比色模式下，随着靶标浓度增加，oxTMB在650 nm处的吸光度线性增强（R2=0.9821），LOD为6 CFU/mL。与近年来其他方法（如微流控纸基传感器、磁弛豫开关生物传感器等）相比，该双模式传感器具有相当或更优的检测限和宽线性范围。

**3.5 Selectivity（选择性）**
在相同条件下检测副溶血性弧菌、创伤弧菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，仅副溶血性弧菌产生显著吸收信号，其他菌信号极低，证实了适配体对靶标的高特异性，表明传感器具有良好的选择性。

**3.6 Real sample assay（实际样品检测）**
以海水为实际样品，加标已知浓度（10⁵–10⁷ CFU/mL）的副溶血性弧菌，三次重复测量得到回收率为95.83%–102.8%，验证了方法在实际基质中的准确性和可靠性。

**结论与未来展望**
本研究成功开发了一种基于rGO–NH₂/Fe₃O₄/AuNPs纳米复合物与CQDs-适配体集成的双模式传感平台。荧光模式依赖FRET机制，靶标结合后恢复荧光；比色模式利用纳米复合物的类过氧化物酶活性催化TMB氧化。系统在两种模式下均表现出强线性、低检测限和良好重现性。荧光灵敏度更高，比色则便于可视化检测。该平台为副溶血性弧菌检测提供了有效工具，有望应用于食品安全监测和环境分析。未来可进一步优化稳定性、采用新型适配体或信号放大策略、集成便携式设备（如纸基传感器或微流控）及智能手机读出示，并将该平台推广至其他病原体或生物分子的检测。