免疫检查点抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌患者中循环肿瘤细胞程序性死亡配体1表达与氟-18-氟代脱氧葡萄糖代谢参数的预后及预测价值

《Cancer Medicine》：Prognostic and Predict Value of Peripheral Blood Circulating Tumor Cells Programmed Death-Ligand 1 Expression and F-18-Fluorodeoxyglucose Metabolic Parameters in Patients With Advanced Non-Small Cell Lung Cancer Treated With Immune Checkpoint Inhibitors

　　

研究目的为探究肿瘤组织与循环肿瘤细胞（CTCs）中程序性死亡配体1（PD-L1）表达的一致性与相关性，探讨上皮-间质转化（EMT）与CTCs中PD-L1表达的内在联系，并评估氟-18-氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG）正电子发射断层显像/计算机断层扫描（PET/CT）代谢参数、CTCs及其PD-L1表达对晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者早期肿瘤反应及长期预后的预测价值。研究方法为纳入42例接受免疫检查点抑制剂（ICI）单药或联合化疗作为一线治疗的晚期或转移性NSCLC患者，检测治疗前外周血CTCs及CTCs上PD-L1表达。收集并测量18F-FDG PET/CT肿瘤代谢参数，包括最大标准化摄取值（SUVmax）、瘦体质量标准化摄取值（SUL）、代谢肿瘤体积（MTV）、总病灶糖酵解量（TLG）、全身代谢肿瘤体积（WMTV）和全身总病灶糖酵解量（WTLG）。采用实体瘤疗效评价标准（RECIST标准）于ICI治疗后8周监测早期肿瘤反应，分析早期应答者与未应答者之间CTC PD-L1表达、FDG代谢参数及临床数据的差异。最后对入组患者进行随访，评估无进展生存期/总生存期（PFS/OS）及其相关预测因素。采用Bootstrap内部验证（1000次重复抽样）评估上述预后模型的稳健性。研究结果显示，肿瘤组织和CTCs中PD-L1阳性细胞百分比代表患者不同的免疫特征，两者百分比之间的相关性无统计学意义（r = 0.041, p = 0.827）。然而，EMT过程与CTCs中PD-L1表达存在内在联系，随着CTCs中EMT过程的变化，PD-L1表达逐渐升高。此外，肿瘤比例评分（TPS）与SUVmax（r = 0.684；p < 0.001）和SUL（r = 0.603；p < 0.01）呈显著正相关，随着TPS升高，SUVmax和SUL相应增加。治疗8周后出现早期应答的患者SUVmax和SUL值显著更高，但混合CTCs更低（p < 0.05）。SUVmax与PD-L1⁺混合CTCs联合预测NSCLC患者ICI治疗早期反应的灵敏度为81%、特异度为71%，但该联合并未带来预测效能的实质性提升。PD-L1⁺间质型CTCs（HR = 5.520, 95% CI 1.993–15.291）和WTLG（HR = 4.315, 95% CI 1.864–9.991）被确定为PFS的独立预测因素，而PD-L1⁺间质型CTCs（HR = 2.880, 95% CI 1.124–7.381）被确定为OS的独立预测因素。Bootstrap重抽样分析（B = 1000次迭代）显示，PD-L1⁺间质型CTCs和WTLG预测PFS的表观受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.822，Bootstrap校正平均AUC为0.821（95% CI: 0.714–0.917）。对于OS预测，PD-L1⁺间质型CTCs的表观AUC为0.893，Bootstrap验证平均AUC为0.88（95% CI: 0.655–0.975）。此外，PD-L1⁺间质型CTCs与WTLG联合分析显示，WTLG < 1627.4 g且PD-L1⁺间质型CTCs < 1/5 mL的患者PFS和OS延长（中位PFS为12.5个月；中位OS为18.5个月），而WTLG ≥ 1627.4 g且PD-L1⁺间质型CTCs ≥ 1/5 mL的患者PFS和OS最短（中位PFS为1.35个月；中位OS为3.0个月）。PD-L1⁺间质型CTCs ≥ 1/5 mL或WTLG ≥ 1627.4 g的患者PFS和OS介于两组之间（中位PFS为6.0个月；中位OS为8.0个月）。对PD-L1⁺间质型CTCs与WTLG联合预后模型进行稳定性分析，Bootstrap重抽样分析（B = 1000次迭代）显示预测PFS时原始ROC曲线的AUC值为0.821，平均AUC为0.823（95% CI: 0.716–0.914）；预测OS时原始ROC曲线的AUC值为0.875，平均AUC为0.874（95% CI: 0.751–0.966）。

## 一、研究背景与意义

非小细胞肺癌（NSCLC）是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，尽管近年来药物研发和治疗方法不断改进，但患者5年生存率仍然较低。免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现为晚期NSCLC患者带来了新的治疗选择，通过激活机体抗肿瘤免疫反应使相当一部分患者获益。然而，仅少数NSCLC患者对ICI治疗敏感，未经选择的NSCLC患者接受ICI单药治疗的应答率通常不足20%。因此，识别合适的生物标志物以准确评估和预测NSCLC患者对ICI的治疗反应，成为提高ICI疗效的关键挑战。

在众多正在研究的生物标志物中，程序性死亡配体1（PD-L1）表达水平被广泛认为是评估ICI疗效的重要指标。大多数研究聚焦于原发肿瘤组织中的PD-L1表达，试图将其建立为预测治疗结局的标准。虽然PD-L1阳性肿瘤患者在某些情况下表现出更好的治疗反应，但相当比例的PD-L1阳性肿瘤患者对ICI治疗无应答。与此同时，18F-FDG PET/CT和循环肿瘤细胞（CTC）检测在NSCLC免疫治疗中各具优势与局限。18F-FDG PET/CT已广泛应用于肿瘤学领域，能够提供基于功能状态的信息，研究表明基于FDG代谢的半定量参数可反映肿瘤微环境中的免疫细胞状态，从而用于预测ICI治疗反应和预后评估。然而，肿瘤微环境的复杂性及基质细胞的参与可能延迟免疫治疗的疗效显现，早期FDG摄取参数可能无法准确预测长期疗效。此外，肿瘤不同区域的免疫细胞浸润和代谢活性可能存在显著差异，这可能阻碍FDG代谢参数全面反映这一复杂性。

液体活检技术以CTC检测为代表，为患者筛选、治疗监测和疗效评估提供了非侵入性方法。尽管研究已证实肿瘤组织中上皮-间质转化（EMT）与PD-L1表达存在内在联系，但不同CTC亚型与其相应PD-L1表达状态之间的关系尚不清楚。不同CTC亚型及其PD-L1表达预测原发肿瘤PD-L1状态及早期ICI治疗反应的潜力，以及在ICI治疗患者中的预后价值，仍有待探索。此外，初步研究已将FDG代谢参数与CTC联合用于NSCLC的诊断和预后评估，并显示出潜在价值 literaturereporting value。然而，现有研究数量有限，所选半定量代谢参数不一致，CTC生物标志物及分离方法存在差异，导致结论尚不一致。

鉴于此，研究人员开展了一项单中心观察性研究，旨在探究晚期或转移性NSCLC患者中肿瘤组织与CTCs PD-L1表达的一致性与相关性，初步探索CTCs中EMT过程与PD-L1表达的内在关系，评估FDG代谢参数联合CTC PD-L1表达对ICI治疗早期肿瘤反应及生存结局预后的预测价值。

## 二、主要技术方法

该研究的技术路线主要包括以下核心方法：研究样本来自天津某医院42例初诊III-IV期NSCLC患者，均为治疗前未接受过抗肿瘤治疗的患者，计划接受ICI治疗。CTC检测采用基于CanPatrol平台的多探针免疫荧光形态学方法，通过8 μm纳米膜过滤结合红细胞裂解技术进行CTC富集，运用RNA原位杂交（RNA-ISH）技术检测CTCs中PD-L1信使RNA（mRNA）的表达水平，以信号点≥4个/细胞且阳性细胞比例≥1%定义为PD-L1阳性。18F-FDG PET/CT扫描严格按照欧洲核医学协会（EANM）指南执行，采用生物图谱mCT-S64 PET/CT扫描仪，使用TrueD软件分析代谢参数，以SUV绝对阈值2.5定义感兴趣体积（VOI），由两名经验丰富的核医学医师独立阅片。肿瘤组织PD-L1表达采用22C3抗体进行免疫组织化学（IHC）检测，计算肿瘤比例评分（TPS）。疗效评价采用RECIST 1.1标准于治疗后8周评估早期肿瘤反应。统计分析采用SPSS 27.0和R 4.4.0软件，运用Spearman秩相关、Logistic回归、受试者工作特征（ROC）曲线、Cox回归及Kaplan-Meier生存分析等方法，并进行1000次迭代的Bootstrap内部验证。

## 三、主要研究结果

**3.1 患者基线特征**

42例初治III-IV期NSCLC患者入组，中位年龄68岁，男性29例、女性13例。大多数患者（n = 37, 88%）接受抗PD-1/PD-L1治疗联合化疗。CTC在所有42例NSCLC患者中均被检出，PD-L1在CTCs中的检出率达98%，31例患者PD-L1⁺ CTCs ≥ 3/5 mL，占74%。21例（50%）患者肿瘤组织检测出PD-L1表达。值得注意的是，仅1例患者在CTCs和肿瘤组织中均未检测到PD-L1表达，其余19例（45%）肿瘤组织PD-L1阴性患者中，CTCs中检测到PD-L1表达。

**3.2 CTCs与肿瘤组织PD-L1表达的相关性**

Wilcoxon符号秩检验显示，TPS显著低于CTC PD-L1⁺百分比（中位数：0.5% vs. 56%；p < 0.001），两者无相关性（r = 0.03, p = 0.87）。在PD-L1⁺ CTCs ≥ 3/5 mL的31例患者中，TPS仍低于CTC PD-L1⁺百分比（中位数：1% vs. 58%；p = 0.001），仍无相关性（r = 0.041, p = 0.827）。按TPS ≥ 50%分层后，TPS < 50%患者中TPS显著低于PD-L1⁺ CTC百分比（中位数0% vs. 56%, p < 0.001），无相关性（r = 0.023, p = 0.885）；TPS ≥ 50%患者中TPS显著高于PD-L1⁺ CTC百分比（中位数85% vs. 38%, p = 0.016），亦无相关性（r = 0.152, p = 0.745）。由此表明，CTCs的PD-L1状态似乎独立于原发肿瘤组织的PD-L1表达。

**3.3 CTC亚型与PD-L1表达的相关性**

三种CTC亚型中PD-L1表达检出率差异显著：上皮型57%、混合型67%、间质型31%（χ² = 11.5, p = 0.003）。两两比较显示，上皮型与混合型CTCs的PD-L1阳性检出率无统计学差异，但两者均显著高于间质型CTCs。将混合型与间质型CTCs归为M+表型，与上皮型CTCs（E+表型）比较，M+ CTCs的PD-L1⁺ CTC比例显著高于E+（33.3% vs. 11.3%；p = 0.001）。值得注意的是，间质型CTCs与PD-L1表达呈强相关（r = 0.59, p < 0.001），超过混合型CTC的相关性（r = 0.35, p = 0.024）。

**3.4 肿瘤侵袭性/转移潜能及原发肿瘤部位对组织与CTC间PD-L1表达差异的影响**

研究人员引入"PD-L1差异评分"量化肿瘤组织与CTC间PD-L1表达的差异程度。Spearman秩相关分析显示，FDG肿瘤负荷参数（MTV、WMTV、TLG、WTLG）与PD-L1差异评分的相关系数为-0.295至0.084（p > 0.05），代谢活性参数（SUVmax、SUL、SUVmean）与差异评分的相关系数为0.072至0.128（p > 0.05），排除CTC计数极低患者后结果一致。腺癌组与鳞癌组的中位PD-L1差异评分分别为61%和47%，无显著差异（Z = -0.738, p = 0.461）。左肺原发与右肺原发患者的中位差异评分分别为50%和62%，亦无显著差异（Z = -0.518, p = 0.537）。上述结果表明，所检验的临床病理变量均不能显著解释原发肿瘤组织与CTCs之间的PD-L1差异。

**3.5 FDG代谢参数与肿瘤组织PD-L1表达的相关性**

所有原发病灶均显示FDG摄取。TPS与SUVmax（r = 0.684, p < 0.001）和SUL（r = 0.603, p = 0.002）呈正相关，但与肿瘤负荷指标无显著相关。按TPS分层后，SUVmax和SUL随TPS升高而增加（SUVmax: 15.84 vs. 18.63 vs. 26.84; p < 0.001；SUL: 12.35 vs. 14.13 vs. 19.99; p < 0.001）。以1%为阈值，SUVmax和SUL预测TPS阳性的AUC分别为0.736（截断值16.76；灵敏度83%，特异度68%）和0.690（截断值14.99；灵敏度61%，特异度74%）。以50%为阈值，SUVmax的AUC为0.783（截断值17.18；灵敏度100%，特异度53%）。

**3.6 FDG代谢参数、CTCs及其亚型预测NSCLC免疫治疗早期反应的价值**

42例患者经8周ICI治疗后，20例（48%）出现早期肿瘤反应，22例（52%）未出现。早期应答者的基线SUVmax（p < 0.05）和SUL（p < 0.05）显著更高，但PD-L1⁺混合CTCs更低（p < 0.05）。ROC分析显示，SUVmax、SUL和PD-L1⁺混合CTCs预测早期反应的AUC分别为0.725、0.684和0.710。SUVmax与PD-L1⁺混合CTCs联合显示更优的预测效能（AUC = 0.827；灵敏度81%，特异度71%）。Delong检验证实该联合显著优于SUL（p = 0.017），但与SUVmax或PD-L1⁺混合CTCs单独比较无显著差异（p > 0.05）。

**3.7 FDG代谢参数、CTC及其亚型在ICI治疗NSCLC患者中的预后价值**

随访结束时，33例（79%）患者进展，31例（74%）死亡。中位PFS为7.2个月，中位OS为13.4个月。单因素分析显示，远处转移、总CTCs、间质型CTCs、PD-L1⁺间质型CTCs、WMTV和WTLG对PFS和OS均有显著影响。多因素分析确定PD-L1⁺间质型CTCs（HR = 5.520, 95% CI: 1.993–15.291; p = 0.001）和WTLG（HR = 4.315, 95% CI: 1.864–9.991; p < 0.001）为PFS的独立预测因素，仅PD-L1⁺间质型CTCs（HR = 2.880, 95% CI: 1.124–7.381; p = 0.028）独立预测OS。Bootstrap重抽样分析（B = 1000次迭代）显示，PD-L1⁺间质型伞型CTCs和WTLG预测12个月PFS的表观AUC为0.822，Bootstrap验证平均AUC为0.821（95% CI: 0.714–0.917）；预测12个月OS的表观AUC为0.893，Bootstrap验证平均AUC为0.880（95% CI: 0.655–0.975）。

采用中位截断值（WTLG: 1627.4 g；PD-L1⁺间质型CTCs: 1/5 mL）进行Kaplan-Meier分析：低风险组（WTLG低且CTC低；n = 20, 48%）：PFS 12.5个月，OS 18.5个月；高风险组（WTLG高且CTC高；n = 13, 31%）：PFS 1.35个月，OS 3.0个月；中风险组（任一标志物升高；n = 9, 21%）：PFS 6.0个月，OS 8.0个月。Log-rank检验确认组间生存差异显著（p < 0.05）。对联合预后模型进行Bootstrap重抽样分析（B = 1000次迭代），预测PFS时原始ROC曲线AUC为0.821，平均AUC为0.823（95% CI: 0.716–0.914）；预测OS时原始AUC为0.875，平均AUC为0.874（95% CI: 0.751–0.966）。

## 四、讨论与结论

研究人员在讨论部分深入分析了多项关键发现。关于CTC与肿瘤组织PD-L1表达的关系，研究人员指出组织与CTC PD-L1缺乏显著相关性，间质偏移型CTC表型表现出更高的PD-L1表达，但该差异应谨慎解读，因为两种样本类型采用了不同的检测原理。PD-L1⁺混合CTCs是最具免疫逃逸特征的CTC表型。EMT-PD-L1⁺ CTC组合可能识别早期反应不良者。SUVmax/SUL与肿瘤组织PD-L1呈正相关（预测TPS灵敏度高但特异度中等），但FDG摄取受多因素影响。虽然SUVmax/SUL与PD-L1⁺混合CTCs联合未显示总体预测增益，但其互补视角提示在多模态模型中的应用价值。PD-L1⁺间质型CTCs在PFS和OS预测方面优于FDG参数，可能是更强的疾病进展和死亡风险预测因素。关键的是，治疗前PD-L1⁺间质型CTCs联合WTLG实现了显著的预后分层，确立了其风险评估的临床价值。

研究人员详细探讨了细针活检（FNB）取样偏倚对结果的影响，在高TPS肿瘤中PD-L1⁺ CTC比例可能因免疫介导的清除或较低的CTC脱落率而受到抑制。EMT过程对CTC中PD-L1表达的影响方面，研究人员发现间质偏移型CTCs优先表达PD-L1，使其在血行播散过程中实现免疫逃逸，这与Liu等、Raimondi等及Polioudaki等的研究相符。方法学差异方面，组织IHC与CTC RNA-ISH检测原理不同——前者基于膜蛋白染色，后者基于mRNA信号点计数，因此直接数值比较应谨慎，观察到的差异可能同时反映生物学异质性和技术变异。

即

肿瘤细胞利用EMT增强可塑性、循环存活能力和免疫逃逸能力。研究人员分析了患者样本中CTC亚型与PD-L1表达的关系：虽然所有表型均检测到PD-L1⁺ CTCs，但重新分组分析显示M+ CTCs（混合型+间质型）的PD-L1⁺比例显著高于E+ CTCs（11.3% vs. 33.3%）。此外，EMT程度与PD-L1表达的正相关性在间质型CTCs中最强（r = 0.59, p < 0.001），从而假设两者之间存在内在联系。这一假设得到前期分子层面研究的支持，包括Liu等证实的PD-L1与EMT状态的强相关性，以及Raimondi等发现EMT进程中PD-L1⁺ CTC比例显著增加等。

**4.2 FDG代谢参数与CTC预测原发肿瘤PD-L1状态及ICI治疗早期反应的价值**

研究人员观察了TPS水平升高与SUVmax/SUL增加之间的显著正相关。对于预测TPS ≥ 1%阳性，SUVmax > 16.76显示高灵敏度（83%）但中等特异度（68%）。值得注意的是，仅SUVmax > 17.18保留了预测TPS ≥ 50%阳性的能力，以牺牲特异度（53%）为代价获得100%灵敏度。这些结果凸显了FDG参数作为独立预测因素因多因素代谢影响而存在的固有限定性。

与前期研究一致，早期肿瘤应答者的SUVmax和SUL显著高于非应答者。研究人员深入分析了高基线SUVmax在ICI治疗背景下的特殊意义：与传统治疗不同，高SUVmax在ICI治疗中更可能提示肿瘤微环境处于免疫活跃状态，为免疫再激活提供有利条件——高基线FDG摄取可能反映大量浸润免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞等）的代谢需求，而高PD-L1表达通常意味着肿瘤细胞与免疫细胞之间存在活跃相互作用，这种"免疫热肿瘤"对ICI治疗有更高应答率。研究人员同时指出，其研究中88%的患者接受ICI联合化疗，化疗药物可能通过诱导免疫原性细胞死亡和上调肿瘤细胞PD-L1表达来影响基线肿瘤组织PD-L1表达，这是解读结果时需考虑的重要因素。

关于CTC对早期免疫治疗反应的预测相关性，PD-L1⁺混合CTCs数量较高的患者表现出更差的免疫治疗反应。研究人员解释了不同研究间CTC预测价值矛盾发现的原因，主要是方法学异质性，并强调本研究首次进行了CTC亚型特异性PD-L1分析。PD-L1⁺混合CTCs反映ICI耐药患者需个体化临床管理，评估CTC亚型中PD-L1具有预后评估和个体化免疫治疗指导潜力。

**4.3 FDG代谢参数和CTC在ICI治疗NSCLC患者中的预后价值**

多因素分析确定PD-L1⁺间质型CTCs和WTLG为PFS的独立预测因素，仅PD-L1⁺间质型CTCs独立影响OS。研究人员解释，远处转移的预后效应被模型中更具生物学意义的标志物所覆盖：WTLG量化全身肿瘤负荷（包括转移灶），取代了转移状态的定性描述；PD-L1⁺间质型CTCs反映肿瘤的EMT表型和免疫逃逸能力，代表驱动转移和不良预后的核心生物学机制。

研究人员系统阐述了PD-L1⁺间质型CTCs优于其他CTC亚型的三个核心特征：通过EMT获得强转移潜能和抗失巢凋亡能力；PD-L1表达增强与T细胞PD-1结合的免疫逃逸；EMT通过PI3K/Akt/STAT3通路上调PD-L1形成"EMT-PD-L1"放大循环。联合治疗前PD-L1⁺间质型CTCs与WTLG显示出预后价值，与Fu等、Castello等及Zhang等的三项类似研究一致，但本研究进一步进行了CTC亚型分型和PD-L1表型分析。

研究人员坦诚了研究局限性：单中心研究样本量较小（n = 42），虽经Bootstrap内部验证，仍需外部验证；组织与CTC的PD-L1检测方法不同限制了解读；所有肿瘤组织来自FNB，无法分析转移部位；仅分析基线数据，缺乏动态监测；大多数患者接受ICI联合化疗而非单药，可能混淆免疫组织化学和代谢参数的预测作用。

**研究结论**

该研究强调晚期NSCLC中原发肿瘤组织与CTCs之间存在不同的PD-L1表达模式。间质偏移型CTCs中PD-L1表达与EMT特征和生存结局相关，PD-L1⁺混合CTCs对早期免疫治疗反应具有预测相关性。然而，由于组织PD-L1与CTC PD-L1采用不同方法学评估，观察到的差异应谨慎解读，可能同时反映生物学异质性和方法学变异。治疗前PD-L1⁺间质型CTCs与WTLG的联合可能增强预后分层，但这些探索性发现需要在更大队列中使用统一检测方法进行验证。