开发一种用于生物体液中细胞外AGR2检测的快速灵敏EnLIGHT OMEGA检测方法

《SLAS Discovery》：Development of a Rapid and Sensitive EnLIGHT OMEGA assay for extracellular AGR2 Detection in Biological Fluids

　　

前梯度蛋白2（AGR2）是一种内质网驻留蛋白，属于二硫键异构酶家族。AGR2参与蛋白质质量控制和非折叠蛋白反应（UPR）。除了其经典的细胞内功能外，AGR2还以细胞外形式（eAGR2）存在，与肿瘤进展和癌症侵袭性密切相关。研究人员的目的是开发一种从多种生物体液（细胞裂解液、细胞外培养基、血清）中鉴定和定量AGR2的新方法。因此，研究人员建立了一种基于荧光共振能量转移和抗原-抗体特异性结合原理的扩增发光邻近均相检测方法（EnLIGHT OMEGA?）。该方法灵敏、快速，无需洗涤，可检测0.02–300 ng/mL的AGR2。总之，研究人员的研究建立了一种简单、灵敏、快速的方法用于肿瘤学应用中的eAGR2检测，包括癌症耐药性和转移进展。

论文解读：

前梯度蛋白2（AGR2，也称PDIA17）是一种定位于内质网（ER）的蛋白，属于二硫键异构酶家族，参与蛋白质质量控制和非折叠蛋白反应（UPR）。在生理条件下，AGR2主要在ER内发挥折叠功能；然而，研究表明AGR2可被分泌至细胞外（eAGR2），并在多种腺癌（如乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌）中过表达，与肿瘤进展、转移、炎症及治疗抵抗密切相关。eAGR2作为循环生物标志物具有早期检测上皮应激的潜力，但现有检测方法（如ELISA）存在步骤繁琐、耗时长、灵敏度有限等问题。因此，研究人员旨在开发一种简单、灵敏、快速的检测方法，以在多种生物体液中定量eAGR2，从而支持临床转化研究。该研究论文发表于《SLAS Discovery》。

为开展该研究，研究人员采用了几项关键技术方法：首先，通过在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化重组人AGR2蛋白（GST-AGR2融合蛋白，经GSTrap亲和层析和凝血酶切后获得），用作校准标准品。其次，利用EnLIGHT OMEGA技术建立均相检测：将羊抗人AGR2多克隆抗体偶联至Chemibeads⁶¹⁵，并将同一抗体生物素化，通过链霉亲和素Sensibeads⁶⁸⁰捕获，基于荧光共振能量转移原理实现无洗涤快速检测。样本来源包括多种人源和小鼠细胞系裂解液、条件培养基，以及来自异种移植模型（NMRI裸鼠，分别植入空载体EV或AGR2过表达细胞）的血清样本（n=3每组）。通过标准曲线、灵敏度、特异性及与ELISA的对比验证方法性能。

研究结果部分包括以下几个方面：

**3.1 Development and validation of an AGR2 quantification assay using EnLIGHT OMEGA**：研究人员首先通过间接检测验证了羊抗hAGR2抗体的功能，加入过量羊IgG显著降低背景信号，优化后最低检测限（LOD）约1 ng/mL，动态范围达100 ng/mL。随后建立直接夹心法，重组hAGR2标准曲线显示背景信号极低（<200计数），信噪比>100，LOD约0.02 ng/mL，动态范围超过2 log。进一步优化显示，1 nM生物素化抗hAGR2抗体配合20 μg/mL链霉亲和素Sensibeads⁶⁸⁰和20 μg/mL抗hAGR2偶联Chemibeads⁶¹⁵可获得最佳性能。与商品化hAGR2蛋白（Prospec）的对比曲线无显著差异，表明方法稳健；与同源蛋白hAGR3（约65%序列同源性）的交叉反应性仅约0.18%（1 μg/mL时），证实高选择性。

**3.2 Detection of AGR2 across physiological cell lines models**：在细胞裂解液中，EnLIGHT OMEGA检测了多种上皮细胞系（如HC11、4T1、MCF-7、T47D、HCT116、RKO、LS174T、OAW42、HeLa）的细胞内AGR2水平，结果与Western blot定性一致，且动态范围更宽。在A549细胞中，敲低AGR2（shAGR2）使细胞内水平从29.8 ng/μg降至4.9 ng/μg；在卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞中过表达AGR2后，细胞内水平分别升至24.1 ng/μg和93.26 ng/μg。在细胞外培养基中，敲低后eAGR2从326.8 pg/mL降至112 pg/mL；过表达后，OVCAR3从14.8 pg/mL升至432 pg/mL，SKOV3从101.6 pg/mL升至824.2 pg/mL，检测窗口显著。未稀释培养基会降低灵敏度，而1:30稀释后可改善检测。

**3.3 Detection of eAGR2 in mouse serum from xenograft models**：在异种移植小鼠血清中，1:300稀释血清可维持稳健检测。AGR2过表达组的eAGR2水平（26.26 ng/mL）显著高于空载体对照组（0.91 ng/mL）（p<0.01）。与商品化ELISA对比，ELISA同样检测到显著升高（5.91 ng/mL vs 0.64 ng/mL），两种方法的相关性系数为0.9320，但EnLIGHT OMEGA测得的绝对浓度更高，可能因无洗涤步骤和抗体差异导致。

**3.4 Comparison of EnLIGHT OMEGA and conventional ELISA for AGR2 detection**：EnLIGHT OMEGA将操作步骤从ELISA的10+步减少至4步，总时长从5-6小时缩短至2小时以内，且样本和试剂用量更小。动态范围方面，EnLIGHT OMEGA在血清、上清和裂解液中覆盖4.0-4.9 log，而ELISA仅2.45 log；LOD相似（0.012-0.02 ng/mL vs 0.035 ng/mL）。线性回归分析显示在工作范围内具有良好的线性。

讨论部分总结：该EnLIGHT OMEGA检测方法在0.02-300 ng/mL范围内（基于空白的LDL为0.02 ng/mL，仅需5 μL样本）实现了宽动态定量，高灵敏度尤其有利于eAGR2检测，支持其作为临床生物标志物的进一步评估。但需进行批间精密度和分析物稳定性的系统验证，以建立标准化的血清eAGR2定量工具。

结论部分原文翻译如下：我们的检测方法展示了宽动态定量范围，在0.02至300 ng/mL的验证工作范围内测量AGR2浓度（基于空白的LDL），仅需5 μL样本即可达到0.02 ng/mL的生物检测限。这种高灵敏度对于检测eAGR2尤为有利，并值得在匹配的临床队列中进一步评估作为生物标志物的潜力。尽管前景可期，但这些结果必须随后进行批间精密度和分析物稳定性的系统验证。这些步骤对于将EnLIGHT OMEGA检测方法建立为临床应用中血清eAGR2剂量定量的标准化、可重复工具是必要的。