水中的细胞：结合光学、光热、红外及拉曼显微镜技术实现水合细胞的亚微米级化学成像

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Cell-in-water: complementary optical photothermal infrared and Raman microscopy for submicron chemical imaging of hydrated cells

　　

维多利亚·科罗纳|安娜·诺瓦科夫斯卡|安娜·皮耶查拉|芭芭拉·奥雷霍夫斯卡|米里亚姆·昂格|马尔戈扎塔·巴兰斯卡

波兰克拉科夫30-387，雅盖隆大学化学系，Gronostajowa 2号

摘要

传统的傅里叶变换红外吸收光谱法受限于衍射限制的空间分辨率以及水分子强烈的吸收效应，通常需要将样品脱水，而这会破坏细胞的天然形态。虽然光学光热红外显微镜能够克服分辨率的限制，但要实现对处于天然水合状态细胞的可靠成像仍是一项重大挑战。本研究提出了一种优化的“水中细胞”分析方案，可用于对水合细胞进行亚微米级、无需标记的化学成像。通过使用硅胶密封的微腔体，可以维持稳定的水环境，防止水分蒸发，从而实现长达4小时的稳定成像。借助强大的比率数据分析框架，可以以300–500纳米的横向分辨率观察包括细胞核和脂滴在内的亚细胞结构。通过对水合状态和脱水状态下的单个细胞进行对比研究，验证了该方案的可靠性，发现了与干燥过程相关的显著光谱变化和形态扭曲。这些结果为在水环境中进行无创、高分辨率的生化分析提供了标准化且可重复的工作流程，弥合了传统振动光谱学与先进生物成像技术之间的差距。

引言

传统的傅里叶变换红外（FT-IR）吸收光谱法是无标记生化分析领域的核心技术。[1]然而，将其应用于单细胞成像时却受到两个因素的限制：衍射限制的空间分辨率（通常为3–10微米）以及水分子强烈的红外吸收现象。[2]尤其是酰胺I区和II区的强吸收带，往往需要通过脱水处理才能获得清晰的光谱信号。不幸的是，脱水会导致细胞形态和化学性质的显著变化，如细胞收缩以及亚细胞成分的重排，从而掩盖样本的天然生化状态。[3]、[4]

传统上，拉曼光谱（RS）是用于成像水合生物样本的首选技术。[5]、[6]由于水是弱拉曼散射体，因此拉曼光谱能够在高空间分辨率（约300纳米）下研究水环境中的细胞。不过，基于红外的技术也越来越受到关注，因为与非相干拉曼散射相比，红外技术的吸收截面要大得多，这使得即便在低浓度下也能检测到生物分子。[7]

为了解决红外光谱中水分子吸收的问题，人们采用了多种策略来检测蛋白质甚至活细胞。这些方法包括：

• (i)
  利用薄液层或间隔物缩短光路长度[8]，
• (ii)
  使用专门的液体细胞器或微加工样品架[8]。
• (iii)
  利用同步辐射增加光子通量，提升信噪比[8]、[9]。
• (iv)
  采用计算方法，如精确去除水信号或使用D?O作为替代溶剂[10]。

例如，先前的研究表明，即使存在强烈的水吸收，只要将光路长度缩短到几微米，就能够观测到酰胺I带等关键光谱区域。[8]同样，结合水信号去除技术或用D?O替代水的优化透射测量方法，也被广泛用于水环境中的蛋白质结构分析。[10]最近，基于同步辐射的FT-IR技术进一步提升了信号质量，使得在生理条件下也能对活细胞进行生化分析。[9]

光学光热红外（O-PTIR）显微镜作为一种创新技术，架起了FT-IR与拉曼光谱之间的桥梁。O-PTIR技术采用泵浦-探测策略，通过局部加热改变样品的密度和折射率，间接检测红外吸收信号。[7]由于水的热容较大，O-PTIR测量过程中的温度上升非常轻微，因此其水背景信号远低于FT-IR技术。[7]、[11]这一优势使得O-PTIR成为研究水环境中的生物系统，尤其是细胞的理想技术。为了进一步提升其性能，人们还在开发各种检测方法来降低水背景信号，比如锁相自由光热动态成像[7]、箱形检测技术[13]、宽场定量相位显微镜[14]以及先进的数据分析方法[15]。

近期研究显示，O-PTIR技术可成功用于缓冲液中的细胞光谱分析。2016年，程等人利用自制的系统和CaF?培养皿，实现了对活前列腺癌细胞中脂滴的亚微米级分辨率成像。[16]2021年，加德纳等人采用“三明治”结构，使用厚度为500微米的CaF?窗片，并用过氧化物酶-抗过氧化物酶笔密封形成一层薄薄的疏水膜，对比了相同细胞位置处的O-PTIR光谱与拉曼光谱。[17]藤田等人则使用两片170微米的CaF?盖玻片加上100微米的硅胶间隔物，对活HeLa细胞中的FCCP进行了成像，结果显示其腈基团的信噪比比刺激拉曼成像高出数十倍。[18]此外，还有使用200微米窗片且无需间隔物的简化设计[19]，以及使用500微米窗片来追踪水通道蛋白介导的H?O/D?O交换的研究[14]，这些进一步丰富了该技术的方法体系。

目前，关于水合状态下细胞代谢的研究主要集中在脂质方面，比如脂肪细胞中的从头脂质合成[20]、肝细胞中对油酸的摄取[21]，或是利用氘标记的棕榈酸实时追踪脂滴中的中性脂质。[22]此外，人们还开发了各种特殊的振动探针，比如能在酶促转化后发生峰位变化的“腈类变色龙”探针[23]，以及用于检测碳水化合物运输的探针[15]，这些都体现了O-PTIR技术在监测代谢途径方面的强大功能。

如表1所示，尽管O-PTIR的速度明显快于拉曼光谱（尤其是在单通道成像模式下），但其速度仍慢于配备焦平面阵列探测器的现代FT-IR系统，后者能够同时捕获数千个像素的数据。不过，O-PTIR仍能实现与拉曼光谱相当的亚微米级空间分辨率，同时还保留了传统红外光谱所具备的高信噪比和良好的分子灵敏度。尤为重要的是，O-PTIR采用光热检测方式，这大大降低了水背景对光谱的干扰，远优于传统的FT-IR透射检测方式。[11]

与以往的研究相比，本项工作旨在开发一种全新的分析方法，涵盖样品制备、测量条件以及数据解析等多个方面，以便在水环境中对细胞进行O-PTIR测量。尽管已有不少相关研究报道，但在液体环境中进行O-PTIR测量仍然面临诸多仪器和分析方面的难题，比如样品定位不稳定的问题，以及由于直流电流波动导致的信号不稳定现象。此前用于水环境红外测量的方法包括缩短光路长度、使用微加工样品室，以及其他减少水吸收、提升信号稳定性的方法。“水中细胞”分析方法与这些策略有相似之处，但它与O-PTIR技术的结合使其在空间分辨率以及与水样兼容性方面均优于传统的FT-IR技术。本研究旨在解决在尽可能保持细胞原始状态的情况下对其进行测量的难题，并提出了提取具有生物学意义的生化信息的策略。此外，本研究还评估了O-PTIR与拉曼光谱在表征水环境中的细胞结构（如脂质）方面的互补性。

章节节选

样品制备

HeLa细胞（宫颈癌细胞，女性来源，MERCK公司，产品编号93021013-1VL）被培养在含有高浓度葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基中，该培养基还添加了10%的胎牛血清以及1%的l-谷氨酰胺，培养条件为37摄氏度、5%的二氧化碳环境。这些细胞被接种在直径为10毫米、厚度为0.35毫米的CaF?窗片上，每孔的细胞密度为20,000个细胞（置于24孔板中），随后培养24小时直至细胞达到半融合状态。为了促进

通过O-PTIR技术监测不饱和脂肪酸的摄取情况

本研究利用O-PTIR成像技术来探究癌细胞对外源脂肪酸的摄取情况。这一模型系统既可用于展示该技术的性能，也可用于评估不同分析方法在监测细胞内生化过程方面的局限性。为了追踪不饱和脂肪酸的摄入情况，研究人员让HeLa细胞与d₃₄-OA共同培养，这种物质在光谱的静默区域（1800–2700厘米?1）内，其CD伸缩振动信号十分明显。由于

结论

在本研究中，我们在HeLa细胞与d₃₄-OA培养后，对其进行了高分辨率的O-PTIR成像。通过应用先进的分析方法，包括比率图像分析以及基于直方图的评估，我们得到了细胞内各亚细胞结构的准确分布图。通过将CD键（2100厘米?1）和酯基团（1745厘米?1）的振动信号与蛋白质衍生的信号（酰胺

利益冲突声明

作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：马尔戈扎塔·巴兰斯卡表示自己获得了波兰国家科学中心的资金支持。鉴于她担任《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》期刊的主编，她并未参与本文的同行评审工作，也无法获取有关同行评审的任何信息。对于

致谢

本研究得到了波兰国家科学中心（NCN）的资助，项目编号为Maestro 2022/46/A/ST4/00054，资助对象为马尔戈扎塔·巴兰斯卡。为确保论文的开放获取属性，作者已为基于本次投稿而产生的所有作者接受稿件版本应用CC-BY公共版权许可。此外，该研究还得到了雅盖隆大学“卓越计划——研究型大学”项目的支持。研究过程中所使用的设备也是由相关资助项目提供的。