特定欧洲黄芪属植物的酚类特征与抗氧化潜力：UHPLC–DAD–ESI/TOF–MS比较及体外研究

《Antioxidants》：Phenolic Profile and Antioxidant Potential of Selected European Astragalus Species: Comparative UHPLC–DAD–ESI/TOF–MS and In Vitro Study

　　

黄芪属（*Astragalus*）植物被公认为是具有抗氧化和治疗潜力的生物活性化合物的丰富来源；然而，与众所周知的膜荚黄芪（*Astragalus membranaceus* (Fisch.) Bunge）相比，欧洲物种的探索仍较少。本研究旨在比较波兰境内特定黄芪属物种（*A. cicer* L.、*A. glycyphyllos* L.、*A. membranaceus*）的植物化学组成与体外生物活性。研究人员采用分光光度法和UHPLC–DAD–ESI/TOF–MS分析了根和地上部分甲醇提取物中的酚类化合物。利用DPPH、ABTS、FRAP、CUPRAC、金属螯合、超氧阴离子自由基清除及脂质过氧化（TBARS）试验评估了抗氧化活性。此外，还评估了对α-淀粉酶（α-amylase）、脂肪酶（lipase）、透明质酸酶（hyaluronidase）、酪氨酸酶（tyrosinase）和丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase, BuChE）的酶抑制活性。*A. membranaceus*根展现出最高的总酚含量（199.84 ± 3.64 mg GAE/g提取物）和最强的抗氧化活性（DPPH IC₅₀ = 36.53 ± 1.22 μg/mL；ABTS IC₅₀ = 26.31 ± 0.03 μg/mL），以及最显著的α-淀粉酶抑制（IC₅₀ = 17.78 ± 1.16 μg/mL）。它还表现出对AAPH诱导的脂质过氧化具有中等保护作用。*A. cicer*的地上部分显示出中等的自由基清除能力，并在较高浓度下对脂质过氧化具有最有效的抑制作用。*A. glycyphyllos*的提取物显示出较弱的自由基清除能力，但具有显著的金属螯合特性。部分提取物还表现出对酪氨酸酶和丁酰胆碱酯酶的中等抑制活性。*A. membranaceus*仍然是酚类化合物和抗氧化活性的最强来源；而像*A. cicer*和*A. glycyphyllos*这样的欧洲物种则代表了有前景的、本地产的替代品，可能用于植物疗法和功能性产品。

### 论文解读：欧洲黄芪属植物的酚类特征与抗氧化潜力比较研究

#### 研究背景与问题
黄芪属（*Astragalus* L.）植物因其丰富的生物活性化合物和悠久的传统药用历史而备受关注，尤其在亚洲，膜荚黄芪（*Astragalus membranaceus* (Fisch.) Bunge，AM）作为传统中药“黄芪”被广泛用于免疫调节和抗疲劳。该属植物的活性成分主要包括多糖、三萜皂苷（如黄芪甲苷astragaloside I-IV）和类黄酮（如毛蕊异黄酮calycosin、芒柄花素formononetin）。然而，尽管全球约有2000-3000种黄芪属植物，欧洲本地物种如*Astragalus cicer* L.（AC）和*Astragalus glycyphyllos* L.（AG）的研究却相对有限且零散。这些欧洲物种在当地民间医学中也有应用（如AG在保加利亚用作降压利尿剂，AC在白俄罗斯用于心脏病和胃肠疾病），但其植物化学组成和生物活性与AM的系统性比较研究尚未开展。因此，研究人员旨在评估AC和AG是否具有与AM相当的植物化学特征和生物活性，从而探讨其作为AM在植物疗法中潜在替代或补充来源的可行性。

#### 研究内容与结论
本研究通过比较波兰境内的AM、AC和AG三种黄芪属植物的根和地上部分，系统分析了其酚类成分谱、抗氧化活性及多种酶抑制活性。结果表明，AM根（AMR）具有最高的总酚含量（TPC）和最强的自由基清除能力（DPPH、ABTS、FRAP、CUPRAC），同时表现出最强的α-淀粉酶抑制和中等透明质酸酶抑制活性。AC的地上部分（ACH）在超氧阴离子清除和脂质过氧化抑制方面表现突出，而AG的地上部分（AGH）则显示出最强的铁离子螯合能力。多元统计分析（主成分分析PCA和雷达图）进一步证实AMR整体生物活性最强，而AC和AG在特定方面具有互补优势。该论文发表在《Antioxidants》期刊上。

#### 主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：（1）**超声辅助提取**：以75%甲醇为溶剂，对冻干植物材料（根和地上部分）进行超声辅助冷浸提取；（2）**分光光度法**：分别采用Folin-Ciocalteu法、氯化铝比色法和Arnov试剂法测定总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和总酚酸含量（TPAC），结果以没食子酸当量（mg GAE/g DE）、槲皮素当量（mg QE/g DE）和咖啡酸当量（mg CAE/g DE）表示；（3）**超高效液相色谱-二极管阵列-电喷雾飞行时间质谱（UHPLC–DAD–ESI/TOF–MS）**：在负离子和正离子模式下进行化合物鉴定和半定量分析，利用提取离子色谱图（EIC）分析异黄酮类化合物；（4）**体外抗氧化试验**：包括DPPH自由基清除、ABTS阳离子自由基清除、铁离子还原抗氧化力（FRAP）、铜离子还原抗氧化能力（CUPRAC）、金属螯合活性、超氧阴离子自由基清除（黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系）以及脂质过氧化（TBARS法，利用AAPH诱导血浆和亚油酸体系）；（5）**酶抑制试验**：测定对α-淀粉酶、胰脂肪酶、透明质酸酶、酪氨酸酶和丁酰胆碱酯酶（BuChE）的抑制活性，并以相应标准抑制剂（如阿卡波糖、奥利司他、七叶皂苷、曲酸、多奈哌齐）为对照；（6）**统计分析**：使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，并进行主成分分析（PCA）和Pearson相关性分析。植物材料来源：AC和AG采集于波兰自然种群（AC：Kórnik，AG：Nowy Duninów），AM栽培于波兰比得哥什尼古拉·哥白尼大学药学院药用植物园。

#### 研究结果
**3.1 植物化学分析（Phytochemical Profiling）**
通过分光光度法和UHPLC–DAD–ESI/TOF–MS分析，研究人员发现不同物种和植物部位间酚类组成存在显著差异。AMR的总酚含量最高（199.84 ± 3.64 mg GAE/g DE），而AC地上部分（ACH）较AG地上部分（AGH）的总酚含量略高（150.98 vs. 129.77 mg GAE/g DE）。总黄酮含量在ACH中最高（44.64 mg QE/g DE），AMR次之（43.23 mg QE/g DE），根中含量最低。总酚酸仅在地上部分检测到，AMH中含量最高（11.38 mg CAE/g DE）。UHPLC–MS结果显示，AMH中主要酚类为山奈酚衍生物（如C₃₃H₄₀O₁₉化合物达63.44 mg/g DE）；AMR中主要含二咖啡酰酒石酸（108.6 mg/g DE）；ACH富含黄酮类（如C₂₇H₃₀O₁₅化合物19.96 mg/g DE）和异牡荆素衍生物；AGH则以羟基肉桂酸衍生物（如对香豆酰奎宁酸和芥子酰奎宁酸）和山奈酚衍生物为主。异黄酮（毛蕊异黄酮calycosin、芒柄花素formononetin及其糖苷）含量在AMR中最高（339.81 μg/g DE），AGR次之（327.54 μg/g DE）。所有提取物中均检测到环阿尔廷型皂苷（特征离子m/z 455），但未确认黄芪甲苷I-IV的存在。

**3.2 酶抑制活性（Enzyme Inhibitory Activity）**
- **透明质酸酶抑制**：AMR活性最强（IC₅₀ = 214.51 μg/mL），与阳性对照七叶皂苷相当；其他提取物IC₅₀ > 400 μg/mL。
- **酪氨酸酶抑制**：仅AMR有活性（IC₅₀ = 37.32 μg/mL）；标准品毛蕊异黄酮（IC₅₀ = 3.4 μg/mL）活性接近曲酸（2.93 μg/mL），但其糖苷化衍生物（calycosin-7-O-β-D-glucoside）活性大幅降低（IC₅₀ = 379.8 μg/mL），提示糖基化降低抑制活性。
- **α-淀粉酶抑制**：AMR最强（IC₅₀ = 17.78 μg/mL），但弱于阿卡波糖（0.56 μg/mL）；芒柄花素（4.95 μg/mL）强于其糖苷。
- **脂肪酶抑制**：仅AMR和ACR有活性，AMR（IC₅₀ = 226.7 μg/mL）强于ACR；标准品黄芪甲苷IV（150.70 μg/mL）强于黄芪甲苷III（292.80 μg/mL），但均远弱于奥利司他（1.17 μg/mL）。
- **丁酰胆碱酯酶抑制**：所有提取物无活性，而多奈哌齐IC₅₀ = 6.79 μg/mL。

**3.3 体外抗氧化活性（In Vitro Antioxidant Activity）**
抗氧化试验结果与酚类含量一致。DPPH和ABTS试验中，AMR活性最强（IC₅₀分别为36.53和26.31 μg/mL），ACH次之。铜离子螯合试验中，AGH活性最强（IC₅₀ = 8.57 μg/mL），但远弱于EDTA。CUPRAC和FRAP试验中，AMR还原力最高（24.43和3.37 μg Trolox/g DE）。超氧阴离子清除试验中，ACH活性最强（IC₅₀ = 114.6 μg/mL），但弱于抗坏血酸（35.55 μg/mL）。

**3.4 脂质过氧化试验（Lipid Peroxidation Assays）**
- **亚油酸模型**：ACH在低浓度（0.05-0.1 mg/mL）下保护作用最强（MDA约9.2 nmol/mL），AMR中等，AGR最弱；标准品毛蕊异黄酮和Trolox效果远优于提取物。
- **血浆模型**：AMR在1 mg/mL时MDA降至0.18 nmol/mg蛋白，AGH和ACH也有保护作用，AGR最弱；Trolox效果最强（MDA降至0.02 nmol/mg蛋白）。

**3.5 多变量统计分析（Multivariate Statistical Analysis）**
雷达图显示AMR在TPC、抗氧化（ABTS、DPPH、FRAP、CUPRAC）和酶抑制（α-淀粉酶、脂肪酶）方面综合活性最强。PCA分析（PC1解释67.8%方差）将AMR与强抗氧化参数关联，而AMH和AGR与TFC和超氧清除相关，ACH则与酶抑制（α-淀粉酶、酪氨酸酶、透明质酸酶和螯合）关联。Pearson相关性分析揭示TPC与DPPH、CUPRAC、FRAP、ABTS呈极强正相关（r≈0.96-1.00），α-淀粉酶、酪氨酸酶和透明质酸酶抑制间也存在强正相关（r≈0.91-0.98），而TPAC和螯合活性与其他抗氧化指标相关较弱或负相关，提示其作用机制独立。

#### 讨论与结论
论文讨论部分指出，AMR的强抗氧化和酶抑制活性与其高酚类含量密切相关，而AC和AG则表现出互补性活性。特别是ACH在超氧阴离子清除和脂质过氧化抑制方面具有优势，AGH在金属螯合方面突出。尽管AC和AG的整体活性低于AM，但它们作为欧洲本地物种，具有潜在的应用价值。研究结论部分翻译如下：
**4. 结论**
本研究结果揭示了波兰境内分析的黄芪属物种在植物化学组成和生物活性上存在明显差异。在所研究的样品中，膜荚黄芪（*A. membranaceus*）表现出显著的生物活性，尤其在抗氧化和酶抑制特性方面，这可能与其高酚类化合物含量有关。
重要的是，欧洲本地物种也显示出值得关注的生物活性。特别是野黄芪（*A. cicer*）展现出相当大的抗氧化潜力。这些发现表明，波兰的黄芪属代表物种构成了生物活性化合物的宝贵来源。
总体而言，结果提示欧洲本地物种，尤其是野黄芪（*A. cicer*），可能作为天然抗氧化剂的有前景的补充来源，并可能被视为广泛使用的膜荚黄芪（*A. membranaceus*）的潜在替代或补充品。需进一步的植物化学和体内研究以确认其药理学潜力，并探索其在植物疗法中可能的应用。