《Cells》：Signatures in the Protein Content of Human and Murine Blood Serum Exosomes, in the Context of Major Depressive Disorder, Are Associated with Cytokine Activity
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重性抑郁障碍（major depressive disorder，MDD）是最常见且致残性最强的精神障碍之一。MDD具有多因素性，可影响中枢神经系统、内分泌系统和免疫系统。此外，MDD还可通过共享的信号传导机制影响神经化学与炎症通路，这些机制包括代谢物、可溶性
重性抑郁障碍（major depressive disorder，MDD）是最常见且致残性最强的精神障碍之一。MDD具有多因素性，可影响中枢神经系统、内分泌系统和免疫系统。此外，MDD还可通过共享的信号传导机制影响神经化学与炎症通路，这些机制包括代谢物、可溶性因子以及细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs，包括外泌体）。研究人员在本研究中提出假设：来源于MDD患者或暴露于慢性不可预期轻度应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）小鼠的EVs，包含特异性炎症特征，这些特征可能有助于解释该精神障碍的病理生理机制。研究纳入4组对象：健康女性对照组（n = 8）、MDD女性患者组（n = 12）、健康Balb/C雌性小鼠组（n = 10）以及接受CUMS处理的Balb/C小鼠组（n = 10）。研究人员从人和小鼠血清中分离并表征外泌体富集型EVs，并采用抗体阵列分析其蛋白质内容。结果鉴定出3组具有显著差异的蛋白（p < 0.05）：MDD组人外泌体中有36种蛋白下调；CUMS组小鼠外泌体中有18种蛋白下调；另有12种蛋白在人与小鼠外泌体之间呈差异表达，且多数在CUMS组与MDD组中表现为下降趋势。研究进一步进行生物信息学分析，以确定蛋白—蛋白相互作用及基因本体论（Gene Ontology，GO）功能。结果识别出与MDD和慢性应激相关的信号通路，包括趋化因子（chemokine）通路、细胞因子—细胞因子受体通路、Janus激酶/信号转导及转录激活因子（JAK-STAT）通路、癌症相关通路、Rap1通路、Ras通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路以及细胞因子相互作用通路。这些发现强调了人和小鼠外泌体作为理解抑郁分子机制关键信息来源的重要性。
该文发表于《Cells》，围绕重性抑郁障碍（major depressive disorder，MDD）相关的神经免疫异常展开，重点考察血清来源外泌体富集型细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）所携带的蛋白质信息是否能够反映抑郁状态及慢性应激状态下的分子改变。研究背景在于，MDD患病率高、致残性强，但其病理生理机制仍未被充分阐明。既往研究已提示MDD涉及神经递质失衡、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴紊乱、神经炎症及分子信号异常等多层面变化，同时外泌体因可跨越血脑屏障并介导中枢与外周双向通讯，被认为是解析神经精神疾病机制和筛选外周生物标志物的重要载体。然而，相较于外泌体miRNA研究，MDD相关外泌体蛋白质货载研究仍相对有限，尤其缺乏人类患者与动物模型之间的直接比较。因此，开展该研究的意义在于评估慢性不可预期轻度应激（CUMS）模型在外泌体蛋白谱层面的转化价值，并探索外泌体是否能作为抑郁诊断与监测的潜在信息来源。
研究人员纳入未经药物治疗的女性MDD患者与年龄匹配的健康女性对照，同时建立Balb/C雌性小鼠CUMS模型，以尽量控制性别相关生物学差异对结果的影响。研究结果显示，人与小鼠血清外泌体富集型EVs中均存在与抑郁/慢性应激相关的蛋白质改变，且这些变化主要集中于细胞因子、趋化因子和生长因子相关网络。MDD患者组检测到36种差异蛋白，小鼠CUMS组检测到19种差异蛋白；在人鼠共有可比蛋白中，有12种蛋白呈显著差异，其中部分蛋白在两物种中均下调。进一步的蛋白互作网络和通路富集分析表明，这些改变主要关联于趋化因子信号、细胞因子—细胞因子受体相互作用、JAK-STAT、TNF、Ras、Rap1等通路。研究由此得出结论：抑郁及慢性应激并不只是单纯“高炎症”状态，更可能体现为EV介导的免疫信号失调和细胞间通讯紊乱。该结果的重要意义在于，为抑郁症的神经免疫机制提供了跨物种证据，并支持血清外泌体作为潜在生物标志物来源的应用前景。
在技术方法方面，研究主要采用了以下策略：首先，样本来源包括墨西哥Ramón de la Fuente Mu?iz国家精神病学研究所门诊招募的20名女性受试者，以及同机构饲养的20只Balb/C雌性小鼠；其次，通过CUMS方案结合被毛状态（coat state，CS）评估和强迫游泳实验（forced swim test，FST）确认小鼠抑郁样行为；再次，从人和小鼠血清中采用沉淀法分离外泌体富集型EVs，并通过Bradford法、CD63 ELISA、外泌体标志物抗体阵列、CD63 slot blot及透射电子显微镜（TEM）进行表征；最后，利用人和小鼠细胞因子抗体阵列对EV蛋白货载进行半定量分析，并结合STRING、UniProt、WebGestalt、GO与KEGG完成生物信息学解析。
在研究结果部分，论文首先报告了“Clinical and Biochemical Differences Are Notorious Between Healthy Controls and MDD Patients and Hormone Quantifications in CUMS-Exposed Mice”。该部分通过临床量表和激素指标比较发现，MDD组17项Hamilton抑郁量表（HDRS）评分显著高于健康对照，提示患者确有明确抑郁症状；在人群样本中，卵泡刺激素（FSH）及采血月经周期日存在显著差异，而小鼠CUMS组的皮质酮和17β Estradiol虽有趋势变化但未达统计学显著，说明本研究的人群样本存在一定激素状态差异，而小鼠激素改变不突出。
其次，“Chronically Stressed Mice Show Alteration in Coat State Without Modification to Body Weight”显示，研究人员通过连续周度观察发现，CUMS小鼠自第4至第5周开始出现明显被毛恶化，提示自我照料受损，而体重在组间无显著差异。这说明CUMS方案成功诱导了与抑郁样状态一致的行为学表型，但未引起明显体重改变。
第三，“Chronically Stressed Mice Show Depressive-like Behaviors”表明，经过CUMS处理的小鼠在FST中总不动时间显著延长、首次不动潜伏期显著缩短，支持其形成抑郁样行为。该结果与被毛状态异常相互印证，证明动物模型构建有效。
第四，“Exosome-Enriched EV Array Markers, CD63 Slot Blot and Transmission Electron Microscopy Analysis”主要回答所分离颗粒是否符合外泌体富集型EVs特征。研究通过抗体阵列检测到CD9、CD81、TSG101等常用外泌体标志，CANX极低或未见，提示细胞污染较少；尽管阵列中CD63信号不理想，但slot blot在人和小鼠样本中均确认了CD63存在。TEM进一步显示颗粒大小约为30–180 nm，形态符合小型EV/外泌体样囊泡特征，因此可认为所获样本为外泌体富集型EVs。
第五，“Exosome-Enriched EVs of Humans and Mice: Determination of Total Protein and Quantification”表明，MDD组与CUMS组外泌体总蛋白含量均显著下降；在人类样本中，CD63阳性颗粒相对丰度反而显著升高，且颗粒/蛋白比值升高，提示MDD患者血清外泌体在数量与单位颗粒蛋白负载之间存在结构性变化；小鼠组则未出现类似显著颗粒数差异。这说明抑郁状态下的人外周EV特征改变更为突出，而小鼠主要表现为蛋白货载下降。
第六，“Proteomic and Bioinformatic Analysis of Protein Content of Human and Murine Exosomes”显示，人类样本中有36种蛋白差异表达，小鼠样本中有19种蛋白差异表达。火山图分析进一步指出，人类差异蛋白以下调为主，包括IGF-BP-6、BDNF、BMP-6、EGF-R、BLC、fractalkine、GDNF、ICAM-1等，仅MIP-1α和G-CSF上调；小鼠中同样以下调为主，包括SCF、VEGF、BLC、GM-CSF、fractalkine、IL-2、IL-4、eotaxin、leptin等，仅osteopontin上调。该结果支持抑郁相关EV蛋白变化主要表现为细胞因子/趋化因子和生长因子整体下调，而非普遍升高。
第七，“The Human Protein Cluster Shows a Relationship Between ERBB2/EGFR and Chemokine-Mediated Signaling Pathways”表明，在36种人类差异蛋白中，蛋白互作网络分为多个簇，其中重要的两个簇分别涉及ERBB2-EGFR信号、生长因子相关过程和趋化因子介导信号通路。GO富集提示这些蛋白参与细胞因子介导信号、蛋白激酶B正调控、蛋白磷酸化及神经元死亡负调控；KEGG富集则指向细胞因子—细胞因子受体互作、TNF、MAPK、Ras、PI3K-Akt、JAK-STAT及趋化因子信号通路。说明MDD患者外泌体蛋白货载与免疫调节、细胞生长及神经营养信号的广泛失衡相关。
第八，“The Mouse Protein Cluster Shows a Relationship Between Chemokine and Cytokine Receptor Binding/Interaction”表明，小鼠19种差异蛋白主要形成一个以趋化因子及其受体结合为核心的大型网络。GO分析显示其与粒细胞、白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的趋化和迁移，以及趋化因子/细胞因子介导信号密切相关；KEGG富集集中于细胞因子—细胞因子受体相互作用、趋化因子、IL-17与JAK-STAT通路。这提示慢性应激模型中的EV蛋白谱更突出地反映外周免疫细胞募集和炎症信号通讯变化。
第九，“Comparison of Human–Mouse Proteins Showed a Relationship with Cytokine Activity”指出，人鼠共有的12种可比蛋白构成了跨物种核心信号集合。其蛋白互作网络主要与淋巴细胞趋化、白细胞迁移、STAT蛋白酪氨酸磷酸化正调控和胰岛素样生长因子结合蛋白复合体有关；分子功能则集中于细胞因子活性、CCR趋化因子受体结合、趋化活性和生长因子活性。KEGG分析显示其主要富集于TNF信号、细胞因子—细胞因子受体互作、趋化因子、Toll样受体、JAK-STAT、Rap1和Ras通路。尤其是CXCL13（BLC）与CX3CL1（fractalkine）在两物种中均下调，提示慢性应激与抑郁状态可能共享一定的神经免疫通讯障碍机制。
在讨论部分，研究人员强调，本研究最重要的发现之一是：无论在人类MDD还是小鼠CUMS模型中，EV货载中的细胞因子和生长因子多以下调为主，这不同于将抑郁简单视作“高炎症状态”的传统观点。研究更支持一种“免疫信号失调”模型，即抑郁的核心并非所有炎症介质普遍升高，而是特定细胞间通讯网络被重塑，导致神经免疫稳态破坏。趋化因子超家族、细胞因子—受体相互作用、TNF与JAK/STAT、Ras/MAPK等通路均与神经发生、突触可塑性、小胶质细胞活化、血脑屏障通透性及外周-中枢免疫联络有关，因此这些EV相关蛋白可能不仅是病理状态标志，也可能参与病理传播。作者同时指出，人鼠之间虽存在通路层面的重叠，但部分蛋白具有物种依赖性或相反调控方向，提示CUMS模型仅具部分转化价值，不能完全替代人类MDD。论文还讨论了女性样本专属性带来的激素影响，以及沉淀法分离EV和抗体阵列半定量分析在纯度、灵敏度和动态范围上的局限。
研究结论部分可译为：最终，本研究结果支持在人类和小鼠抑郁及抑郁样行为背景下，血清来源外泌体的蛋白质货载具有重要相关性，可作为理解抑郁障碍分子机制的重要但并非唯一的信息来源。结果提示，MDD和慢性应激均与EV介导的细胞间通讯失调有关，尤其体现在免疫系统和中枢神经系统相关通路中。这种失调进一步表现为细胞因子和生长因子表达降低，提示其反映的是特定信号网络的协调性异常，而非单纯炎症激活。生物信息学分析所见相似性说明，人类与小鼠在炎症和神经炎症相关表达谱方面存在部分同源性，可能影响中枢神经系统中特定脑区和细胞底物。这种人鼠EV谱的部分重叠，在一定程度上支持CUMS模型的部分转化价值。总体而言，这些发现有助于更全面地理解抑郁与慢性应激的分子机制，并支持EVs作为神经精神疾病有前景的生物标志物。
