《Microorganisms》：Development of a Single-Tube Asymmetric ERA-CRISPR/Cas12a Assay for Rapid Visual Detection of Enterocytozoon hepatopenaei in Shrimp
注意力缺陷多动障碍（Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder, ADHD）是一种常见的神经发育性疾病。越来越多的证据表明，肠-脑轴（gut-brain axis）可能参与其发病机制。然而，关于ADHD患者肠道微生物群改变的研究结果尚不一致。本系统综述旨在综合ADHD患者肠道微生物群组成及微生物多样性方面的现有证据。研究人员遵循PRISMA指南，对PubMed、Scopus和Web of Science三个数据库截至2025年12月31日的文献进行了系统检索，共获得562篇研究。最终纳入2015至2025年间发表的23篇研究。大多数研究报道ADHD组与对照组的α多样性无显著差异。更为一致的是，β多样性分析显示ADHD组与对照组间微生物组成存在显著差异。ADHD常与Alistipes属以及丁酸盐产生菌如Faecalibacterium的丰度降低相关，同时与Roseburia和Agathobacter的丰度增加相关。部分纵向研究表明，生命早期的特定微生物模式可能先于ADHD诊断出现。ADHD似乎与肠道微生物群改变相关，特别是参与短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs）产生和免疫调节的分类群。然而，由于方法学异质性和潜在混杂因素，研究结果仍存在不一致。未来研究应优先采用纵向多组学方法以阐明因果机制，并优化靶向微生物群的干预措施。
**引言**
注意力缺陷多动障碍（Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder, ADHD）是一种神经发育障碍，近年来其诊断率显著上升。该疾病以注意力不集中、多动和/或冲动为核心症状，全球约8%的儿童和青少年受其影响，且多数症状持续至成年。ADHD给患者日常生活带来严重影响，包括生活质量降低、教育水平和职业功能受损、人际关系困难，以及更高的犯罪风险和其他精神障碍共病率。据2021年系统综述估计，ADHD人均总成本为831.38至20,538美元，国家层面成本高达3.56亿至202.7亿美元。近十年来，肠道微生物群研究急剧增长，特别是在其与神经发育和精神障碍的关联方面。肠-脑轴（gut-brain axis）是中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）与胃肠道之间的双向通讯网络，通过神经、内分泌和免疫途径实现。特定肠道细菌可分泌γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）、多巴胺和5-羟色胺等神经递质，这些递质与ADHD的发病机制相关。此外，迷走神经在ADHD中也可能发挥重要作用，研究发现ADHD儿童迷走神经活动和副交感神经张力降低。肠道菌群失调可导致肠道通透性增加，引发全身性炎症，这也解释了ADHD患者炎症标志物升高的现象。动物研究显示，移植ADHD患者粪便微生物后，小鼠出现脑结构和功能改变以及行为变化。人体研究也记录了ADHD患者与正常人肠道微生物群组成的差异。近期研究表明，益生菌补充可能改善ADHD症状，减轻多动并提高学业表现。然而，研究间结果不一致，存在混杂因素控制不佳、样本量小和方法学异质性等局限。因此，阐明肠道微生物群与ADHD的关系对于深入理解该病理机制及开发益生菌、益生元和饮食调节等靶向干预措施至关重要。
**材料与方法**
本系统综述严格遵循Cochrane系统综述干预手册和PRISMA（Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses）声明进行。检索策略覆盖PubMed、Scopus和Web of Science三个数据库，检索时间截至2025年12月31日，采用MeSH（Medical Subject Headings）主题词与自由词结合的方式，主题词组合为：（ADHD OR "attention-deficit" OR hyperactivity OR "hyperactivity disorder"）AND（microbiota* OR microbiome*）AND（child* OR children*），检索过程不限制语言，但最终纳入分析的研究均为英文发表。纳入标准包括：（i）18岁以下人类ADHD患者；（ii）研究肠道或肠道微生物群和/或微生物组分析；（iii）包含对照组。研究筛选和数据提取由两名独立评审员完成，分歧通过共识解决。
共获得562篇参考文献，经去重和筛选后最终纳入22篇研究。由于研究在临床变异性、方法学差异、统计学异质性和结局报告异质性等方面存在显著差异，未进行荟萃分析。偏倚风险根据研究设计采用相应工具评估，包括Cochrane RoB 2、ROBINS-I、Newcastle-Ottawa量表、Joanna Briggs研究所关键评价清单以及ROB-MR。
**结果**
**研究特征**
纳入的22篇研究发表于2015至2025年间，涵盖12项横断面研究、6项随机对照试验、3项前瞻性队列研究和1项双样本孟德尔随机化（Mendelian Randomization, MR）研究。研究地域分布广泛，以亚洲国家（特别是中国和台湾）最为多见，欧洲、大洋洲和北美洲也有贡献。研究样本量从17人到16,640人不等，多数横断面微生物组分析纳入30至110名参与者，干预试验规模通常较小（n=17-76）。参与者主要为6-16岁儿童青少年，男性占比常超过60%，符合ADHD流行病学特征。
**ADHD诊断、用药状态与膳食评估**
ADHD诊断主要基于《精神障碍诊断与统计手册》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, DSM）标准（DSM-IV、DSM-IV-TR或DSM-5），常用评估工具包括儿童情感障碍与精神分裂症访谈表（Kiddie Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia, K-SADS）及其各版本、ADHD评定量表（ADHD Rating Scale, ADHD-RS）、Conners量表、Swanson, Nolan, and Pelham Questionnaire IV（SNAP-IV）和韩国ADHD评定量表（K-ARS）等；少数研究采用《国际疾病分类》第10版（International Classification of Diseases, ICD-10）标准。用药状态在各研究间存在差异，部分横断面研究排除用药者，部分纳入混合人群；干预试验中参与者或停药、或接受稳定哌甲酯治疗、或在标准药物治疗基础上联合饮食干预。精神兴奋剂（主要为哌甲酯）是最常用的药物，但其可能影响肠道微生物群组成，构成潜在混杂因素。膳食摄入评估方式不一，部分研究排除素食者，部分采用食物频率问卷（Food Frequency Questionnaire, FFQ）或膳食日记记录。多数研究排除了近2周至3个月内有抗生素或益生菌暴露史的参与者，但标准各异。
**干预措施**
干预研究包括围产期益生菌补充（Lactobacillus rhamnosus GG）、双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum, Bf-688）辅助补充、多菌株益生菌或合生元补充、微量营养素补充，以及引入低凝集素饮食等干预方式。多数干预试验持续6至16周，一项围产期随访研究长达13年。
**微生物群/微生物组方法学**
所有研究均将粪便样本保存于-80°C直至提取。DNA提取方法多样，常用试剂盒包括QIAamp DNA Stool Mini Kit、PowerFecal kits（Qiagen）、DNeasy Blood and Tissue Kit、FastDNA Spin Kit for Soil、PowerSoil Pro extraction kit等，部分研究采用自动化提取系统。约18项研究通过16S rRNA基因测序（Illumina MiSeq平台）表征肠道微生物群落，靶向区域包括V1-V2、V3-V4和V4区；两项研究采用鸟枪法宏基因组测序，可实现种水平分类学分辨率和功能谱分析；一项孟德尔随机化研究使用全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）汇总统计而非直接微生物组测序。分类学鉴定参考数据库包括SILVA、GreenGenes、Ribosomal Database Project（RDP）、MetaPhlAn2、EzBioCloud和统一人类胃肠道基因组（Unified Human Gastrointestinal Genome, UHGG）数据库等，方法学差异构成研究间异质性的重要来源。
**多样性分析**
**α多样性**
22项研究中，关于微生物丰富度和均匀度（α多样性）的结果大体不一致。多数横断面分析显示ADHD患者与对照组在Shannon、Chao1、Simpson、基于丰度的覆盖度估计量（Abundance-based Coverage Estimator, ACE）和Faith系统发育多样性等多个多样性指数上无显著差异。当检测到显著差异时，各研究的贡献指标不一：一项队列研究仅Shannon指数降低，另一项显示Shannon和Simpson指数均降低；部分研究主要由amplicon sequence variant（ASV）丰富度和Faith系统发育多样性等丰富度指标降低驱动；另有研究报道ADHD组α多样性升高，包括更高的Chao1和Shannon指数及更低的Simpson指数，以及更高的Faith系统发育多样性。纵向研究表明关联可能具有年龄依赖性：6个月时Faith系统发育多样性较高的儿童后来发展为ADHD；而另一项纵向研究发现ADHD组Bifidobacterium、Coprococcus、Alistipes、Roseburia、Akkermansia和Phascolarctobacterium水平较低，Megamonas funiformis和Veillonella parvula水平较高。干预研究结果不一致：微量营养素补充增加均匀度相关指标；益生菌试验中，一项研究显示干预组和安慰剂组Shannon和Chao1均有显著变化，另一项则无显著变化；低凝集素饮食未显著改变α多样性。此外，精神兴奋剂治疗与未用药ADHD患者相比α多样性更低。
**β多样性**
β多样性结果虽仍存在异质性，但组间差异的报告较α多样性更为一致。多项研究采用UniFrac、Bray-Curtis或Jaccard距离度量，报告ADHD患者与对照组间整体微生物群落组成存在显著差异；部分研究则因微生物组成的高个体间变异性未观察到明确的组间分离。纵向分析中，6个月龄时的微生物组成在后来发展为ADHD的儿童与神经典型对照之间存在差异。干预研究中，微量营养素补充和益生菌治疗在部分试验中显著改变了与安慰剂相比的β多样性，而其他试验未报告前后差异。
**分类学组成**
ADHD最常见与Firmicutes（厚壁菌门）减少和Proteobacteria（变形菌门）增加相关。Actinobacteria（放线菌门）研究结果不一致。其他发现包括Fusobacteria（梭杆菌门）增加，以及Verrucomicrobiota（疣微菌门）、Desulfobacterota和Bacteroidota（拟杆菌门）减少。Prevotellaceae（普雷沃菌科）是ADHD中最一致减少的科，而Rikenellaceae、Porphyromonadaceae和Ruminococcaceae等科结果不一。
属水平上，Faecalibacterium和Alistipes最为频繁地表现为减少；相反，Roseburia和Agathobacter常见增加。Bifidobacterium、Odoribacter、Parabacteroides、Prevotella和Lactobacillus等属趋势不一致。种水平上，Bacteroides uniformis是ADHD中最一致增加的物种。
**纵向研究：微生物轨迹**
早期生命微生物群在ADHD诊断前数年即呈现不同轨迹。1个月龄时，后来发展为ADHD的儿童Dorea、Pseudoramibacter、Eubacterium、Lachnospiraceae、Prevotella和Veillonella丰度较低，而Megasphaera、Clostridiaceae、Lactococcus、Bacteroides、Streptococcus、Akkermansia muciniphila和Collinsella aerofaciens丰度较高。6个月时，51个细菌操作分类单元（Operational Taxonomic Units, OTUs）丰度较低（包括Enterococcus、Ruminococcus和多个Lactobacillales），Dorea和Blautia丰度较高。
**干预效果**
围产期Lactobacillus rhamnosus GG补充与后期神经精神障碍较低发生率相关（安慰剂组17.1% vs. 益生菌组0%；p=0.008）。已确诊ADHD中，益生菌与微生物组成改变相关，增加Odoribacter并减少Escherichia-Shigella；微量营养素补充减少Actinobacteria丰度，并适度增加Proteobacteria；Bifidobacterium bifidum（Bf-688）补充增加Firmicutes/Bacteroidetes比值；低凝集素饮食联合标准治疗后Lactobacillaceae、Pasteurellaceae和Pasteurellales占优势。精神兴奋剂药物显著影响微生物景观，与9个不同属的较低丰度相关，同时特异性增加Anaerostipes丰度。
**真菌组（Mycobiome）**
仅两项研究调查了真菌组，均评估真菌分类学组成。门水平上，ADHD与Ascomycota（子囊菌门）增加和Basidiomycota（担子菌门）减少相关；较低分类水平上，Candida在ADHD患者中富集，C. albicans和C. tropicalis水平升高。早期队列中，1个月龄时多个真菌OTUs减少；6个月时Candida和Saccharomyces减少，Trichosporon增加。
**孟德尔随机化的因果推断**
基因组代理标志物识别出与ADHD风险增加相关的特定属，包括Eubacterium hallii group、Ruminococcaceae UCG013和Ruminococcus torques group；而Butyricicoccus、Roseburia、Desulfovibrio、Romboutsia、Oxalobacteraceae和Peptostreptococcaceae等可能具有保护作用。Roseburia存在反向因果关系提示，提示ADHD相关行为可能驱动高糖低纤维的饮食选择，从而抑制有益纤维发酵菌的生长。
**微生物群与症状严重程度及临床改善的相关性**
多项分类群与症状严重程度相关：Faec Bluesp;alibacterium与总分和多动评分负相关；Ruminococcus gnavus、Agathobacter和Acidaminococcus与行为和情绪症状相关；Sutterella stercoricanis和Bacteroides ovatus与多动评分正相关；较高Bifidobacterium丰度与较低ADHD-IV-RS评分相关。微量营养素后临床改善与Oscillospiraceae和Rikenellaceae增加、Actinobacteria减少及儿童全面评定量表（Child Global Assessment Scale, C-GAS）改善相关。Bf-688改善持续性操作测试（Continuous Performance Test, CPT）表现；低凝集素饮食改善多项临床评分；多菌株合生元产生小的家长报告改善，但未直接与微生物群变化关联。
**偏倚风险—质量评估**
22项研究中，总体偏倚风险最常评为"存在一定顾虑"（n=6）或"中等"（n=6），另有相当比例为"中高"（n=4）、"高"（n=4）或"严重"（n=1）顾虑。7项随机试验中6项存在"一些顾虑"，1项为"高风险"；10项病例对照研究主要为中到中等偏高风险，主要局限在于对照选择和混杂因素控制不完整；横断面研究根据JBI清单为中等至高风险，主要由于残余混杂和样本量小；队列研究风险一般较低，反映较强的时序关系但仍易受失访和残余混杂影响；非随机饮食干预研究被判定为"严重"偏倚风险；孟德尔随机化研究评为"一些顾虑"，反映潜在工具变量弱点和水平多效性。
**讨论**
本系统综述综合了22项探索肠道微生物群组成与ADHD关系的研究证据。总体而言，结果提示该神经发育障碍与肠道微生物群落改变之间存在潜在关联，但差异的方向和幅度高度异质，似乎取决于年龄、用药状态、饮食模式和分析方法学差异等多种因素。
**多样性发现**
α多样性结果不一致，多数研究无显著差异，少数描述多样性降低或升高，由不同多样性指数驱动，提示丰富度和均匀度可能在ADHD中受到差异影响。这种变异性可能反映方法学异质性，但也表明整体多样性可能并非ADHD相关菌群失调最敏感的标记，该疾病可能更好地由特定微生物分类群的变化而非整体多样性丧失来表征。β多样性分析更一致地识别出ADHD与对照组间整体微生物群落结构的差异，表明组间变化可能比样本内分析更有效地捕捉ADHD相关微生物改变。
**分类学组成与功能解读**
尽管研究间存在异质性，但几种重复出现的分类学模式浮现。Faecalibacterium和Alistipes减少是最一致的发现之一。Faecalibacterium是肠道中丁酸盐的关键产生菌，在维持肠道屏障完整性、调节神经炎症过程、调控小胶质功能和神经递质合成中发挥核心作用。此外，丁酸盐作为组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylases, HDACs）的抑制剂，其减少可能改变前额叶皮质中脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF）等神经营养因子的表达。Alistipes典型产生琥珀酸盐和乙酸盐，参与色氨酸代谢，该代谢的破坏可影响5-羟色胺合成和犬尿氨酸途径。
相反，Proteobacteria增加常与低度炎症状态和肠道通透性增加相关，与ADHD发病机制一致。Roseburia和Agathobacter增加也常见报道。Odoribacter作为丁酸盐和丙酸盐的重要产生菌，被视为下一代益生菌，研究结果不一致。Ruminococcus gnavus和Bacteroides uniformis是最一致增加的物种，前者与炎症性肠病相关且能降解肠道黏蛋白，后者为具有免疫调节特性的共生菌。SCFAs产生菌的减少与黏蛋白降解菌的增加可能损害肠道屏障，使促炎和细菌代谢产物进入全身循环并最终到达血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）。
**早期生命微生物群**
纵向队列研究提供了特别有力的发现，显示ADHD诊断前数年即存在不同的微生物轨迹。这些结果强化了微生物群改变不仅是疾病或其治疗后果，而可能参与其发育起源的假设。早期丁酸盐产生菌如Lachnospiraceae和Roseburia的减少，以及6个月时51个细菌OTUs的降低，可能具有显著的神经发育后果，可能损害BDNF等神经营养因子的表观遗传调控。Akkermansia muciniphila在生命第一个月增加（与其在较大队列中的减少相比）可能提示时间偏移的重要性，该菌在婴儿期过度增加可能导致过度黏蛋白降解，破坏不成熟的肠道屏障。
**干预效果**
干预研究表明ADHD患者的肠道微生物群是可修饰的，但微生物变化并不总是伴随临床改善，症状改善也不总是与明确的微生物改变相关。围产期Lactobacillus rhamnosus GG补充的成功提示新生儿窗口期靶向微生物群可能对神经发育轨迹产生预防效果。相比之下，已确诊ADHD的干预效果更为温和和局限。微量营养素对Actinobacteria的影响和低凝集素饮食对Lactobacillaceae的影响突显营养状况作为微生物变异重要驱动因素的地位。精神兴奋剂药物与独特的微生物谱型和较低α多样性相关，提示归因于ADHD的部分微生物特征可能与药物相关。
**微生物群与临床结局**
多项微生物分类群与ADHD症状严重程度相关，特别是多动和情绪失调。Faecalibacterium与症状评分的负关联尤为引人关注。关键通路可能涉及迷走神经，其为肠道与大脑之间的直接神经通讯通路。SCFAs作为信号分子刺激迷走神经传入纤维，信号到达蓝斑——大脑去甲肾上腺素产生的主要中枢，而这对调节前额叶皮质的唤醒、注意和执行功能至关重要。ADHD中微生物群诱导的迷走神经刺激缺陷可能导致前额叶皮质刺激不足，为SCFA产生菌较低水平与注意力不集中和多动增加强烈相关提供了生物学解释。
**孟德尔随机化的启示**
孟德尔随机化分析结果为肠道微生物群组成与ADHD之间的潜在因果关系提供了初步证据。Eubacterium hallii group和Ruminococcus torques group等风险相关分类群，以及Butyricicoccus和Roseburia等保护性分类群的识别，提示ADHD风险可能与基线肠道微生物组成相关。Roseburia的反向因果信号尤为启发性，提示ADHD相关行为可能驱动饮食选择，从而抑制有益纤维发酵菌的生长，形成自我延续的恶性循环。
**真菌组**
尽管证据有限，但现有证据提示真菌群落也可能参与ADHD相关的肠-脑互作。ADHD患者中Candida物种的增加以及早期生命真菌定植的发育变化，可能指向超出细菌群落的更广泛生态失调。真菌过度生长常发生在细菌群落耗腾后留下的生态位中，Candida物种可通过促进肠道炎症和破坏上皮紧密连接来损害肠道黏膜层，与细菌菌群失调协同增加肠道通透性和全身炎症。
**临床与研究意义**
当前证据似乎不支持存在单一的ADHD特异性微生物特征。相反，ADHD似乎与SCFA产生、免疫调节和神经递质代谢相关的微生物通路改变相关。这些发现提示ADHD管理可能受益于分层方法。早期生命微生物轨迹的识别可能为预防性干预打开窗口。对于已确诊ADHD，药物治疗单独可能不足，辅助性营养方法可能值得作为补充策略进行研究，根据个体特定微生物缺陷量身定制饮食和补充剂（如使用益生元促进多动评分高的患者的Faecalibacterium）。未来研究应优先采用从早期生命开始的纵向设计，结合宏基因组学和代谢组学等多组学方法，并实现更大的方法学标准化，包括一致的多样性指标报告和改进的混杂因素控制，以及按用药状态和ADHD表型分层，以提高研究间的可比性。
**本综述的优势与局限**
主要优势在于整合性方法，综合了多种研究设计，包括横断面研究、纵向队列、随机对照试验和孟德尔随机化分析，并纳入关于肠道真菌组和早期生命轨迹的新兴证据。然而，显著局限仍然存在，最突出的是高度方法学异质性（包括小样本量、主要为横断面设计、测序区域和参考数据库差异、关键混杂因素控制不足），这阻碍了荟萃分析的实现。此外，多数研究依赖16S rRNA测序，限制了分类学转变之外的实际功能和代谢输出的理解；膳食模式和药物使用的不一致控制意味着观察到的ADHD特异性菌群失调仍部分被生活方式和药理学混杂因素的噪音所掩盖。本系统综述未在PROSPERO前瞻性注册，可能增加报告偏倚风险。
**结论**
本系统综述突显了越来越多的将ADHD与肠道微生物群组成变化相联系的证据。虽然没有发现与ADHD相关的特定微生物特征，但重复出现的模式提示参与短链脂肪酸产生、免疫调节、肠道屏障完整性和神经递质代谢的微生物通路受到干扰。特别是，关键丁酸盐产生分类群的减少与黏蛋白降解和潜在促微生物的富集相结合，可能促进将肠道菌群失调与神经发育和行为结局联系起来的机制。纵向证据表明微生物群改变可能早期出现，提示肠道微生物组可能参与ADHD的发育起源。更重要的是，微生物群定植的时间可能至关重要，早期发育窗口期的干扰可能影响长期肠-脑信号传导。尽管干预研究表明微生物群是可修饰的，但迄今为止的治疗方法的临床效果不一，提示最相关的微生物通路尚未确定。总体而言，这些发现提示ADHD与肠-脑轴内的功能破坏相关，而非单一的分类学特征。然而，鉴于方法学异质性和纳入研究的中高偏倚风险，解释应保持谨慎。未来研究应优先采用纵向队列研究、多组学方法以及改进的方法学标准化，以阐明因果机制并识别临床上有意义的微生物靶点。此类进展可能最终有助于确定微生物组知情的预防策略和ADHD个性化干预是否可行且具有临床意义。
