SHLD2缺失是Polθ抑制联合放疗的合成脆弱性

《SCIENCE ADVANCES》：SHLD2 loss is a synthetic vulnerability to Polθ inhibition combined with radiotherapy

　　

抑制DNA聚合酶θ（Polθ），一种通过微同源末端连接（MMEJ）修复DNA双链断裂（DSBs）的关键酶，已被证明在HR缺陷肿瘤模型中是一种极其有效的单药治疗。此外，Polθ抑制（Polθi）可诱导肿瘤选择性放射增敏，但与单药治疗不同，尚未鉴定出临床上可操作的生物标志物来预测此效应。在此，研究人员分析了54种癌细胞系，发现Polθi在大多数模型中诱导了显著的放射增敏，尽管存在明显变异性，且不能用Polθ活性指标解释。为了确定Polθi放射增敏的分子决定因素，研究人员进行了CRISPR敲除筛选，揭示TP53BP1/Shieldin通路组分SHLD2（FAM35A）的缺失是Polθi联合放疗（RT）的脆弱性。研究人员发现SHLD2在一部分人类前列腺癌中缺失，常伴随不良预后因子PTEN缺失。研究人员证明SHLD2缺失不仅如先前报道增加单独RT的敏感性，而且增强Polθi的放射增敏效应，该效应独立于PTEN状态且无需HR缺陷。此外，研究人员的发现支持一个模型，其中SHLD2缺失增加RT后对Polθ的依赖性，Polθ活性通过独立于经典MRE11/CtIP介导的DNA末端切除的补偿机制，限制DSB积累和染色体不稳定性。总之，研究人员发现SHLD2缺失是一种可通过Polθi和RT联合治疗利用的附带脆弱性。

研究背景：放射治疗（RT）在多种实体瘤治疗中发挥关键作用，但传统联合化疗的副作用缺乏肿瘤特异性。Polθ抑制（Polθi）已被证明能实现肿瘤选择性放射增敏，然而其效果在不同肿瘤中存在显著差异，且缺乏临床可操作的预测生物标志物。为了确定Polθi放射增敏的分子决定因素并拓展其临床应用潜力，研究人员开展了本研究。

研究人员通过54种肺癌、结直肠癌和头颈癌细胞系筛选，发现Polθi（ART558）诱导放射增敏效果变异大，且不依赖于Polθ活性指标。随后进行的CRISPR敲除（KO）筛选（靶向2776个DNA损伤应答及癌症相关基因）揭示了TP53BP1/Shieldin通路组分SHLD2（FAM35A）缺失是Polθi联合RT的脆弱性。在前列腺癌队列（TCGA、SU2C/PCF等）中，SHLD2缺失频率高达10%，且常与PTEN缺失伴发。体外克隆形成实验和体内异种移植模型（NRG小鼠）证实：SHLD2缺失显著增强Polθi（ART558/ART899）的放射增敏效应，且独立于PTEN状态和HR缺陷。机制上，SHLD2缺失后细胞对Polθ依赖性增加，但该效应不依赖MRE11/CtIP介导的DNA末端短程切除。该研究发表于《SCIENCE ADVANCES》，为HR缺陷以外的患者群体提供了新的联合治疗策略，SHLD2可作为潜在生物标志物用于患者分层。

主要关键技术与方法：研究人员采用了54种癌细胞系面板（含肺癌、结直肠癌、头颈癌），来源自公共细胞库（如ATCC等）；进行了基于慢病毒文库的CRISPR KO筛选（靶向2776个基因），结合MAGeCK分析鉴定基因；利用cBioPortal公共数据库分析前列腺癌样本（TCGA、SU2C/PCF等队列）的SHLD2缺失频率；通过CRISPR-Cas9技术生成SHLD2敲除（KO）细胞克隆（DU145、22Rv1、CAL-51）；使用克隆形成实验评估放射敏感性；采用免疫荧光显微镜检测γH2AX、53BP1、RAD51等焦点和微核；体内实验使用NRG小鼠皮下移植瘤模型，以分次RT（4×2 Gy）联合Polθi（ART899）处理。

研究结果：
1. Polθi诱导的放射增敏在不同癌细胞系中变异且与Polθ活性指标无关：通过54种癌细胞系分析，72%的细胞系表现出显著放射增敏（SF_ART558/SF_DMSO < 0.9），但增敏程度与POLQ表达或Polθ生成疤痕频率无相关性，提示存在其他决定因素。
2. CRISPR KO筛选鉴定Polθi放射增敏的遗传调节因子：在DLD-1细胞中进行筛选，发现TP53BP1/Shieldin通路组分（SHLD2、SHLD3、TP53BP1）的敲除与联合治疗敏感性增强相关，其中SHLD2为最高排名基因，其缺失在多个时间点和剂量下均表现为协同效应。
3. 前列腺癌患者中SHLD2频繁缺失：数据库分析显示，多达10%的前列腺癌样本存在SHLD2纯合缺失，且约79-100%的SHLD2缺失肿瘤同时伴有PTEN缺失，提示SHLD2缺失为附带事件，但可成为治疗靶点。
4. SHLD2缺失与Polθi联合RT在体外产生协同效应：在HR功能完整的DU145、22Rv1及CAL-51细胞中，SHLD2敲除克隆对RT单独敏感性增加，且Polθi（ART558）的放射增敏效应显著增强，该效应与PTEN状态无关；SHLD2回复表达可逆转该效应；而POLQ敲除则完全消除ART558的放射增敏活性。
5. SHLD2缺失细胞在RT后依赖Polθ限制DSB积累和基因组不稳定性：免疫荧光显示，SHLD2敲除细胞在RT后γH2AX、53BP1、pATM、RAD51焦点及微核形成均显著增加，而Polθi处理进一步加剧这些变化，表明SHLD2缺陷细胞对Polθ依赖性增强。
6. SHLD2缺失细胞中Polθi放射增敏不依赖MRE11/CtIP介导的DNA末端切除：通过siRNA敲低MRE11或CtIP，虽抑制切除和RAD51焦点形成，但不改变Polθi的放射增敏效应，也不逆转DSB积累，表明Polθ通过独立于经典切除的机制发挥作用。
7. SHLD2缺失肿瘤在体内对Polθi联合RT高度敏感：在NRG小鼠异种移植模型中，ART899联合分次RT显著抑制SHLD2缺失肿瘤生长并延长生存，而SHLD2野生型肿瘤无此效果；Bliss协同分析证实两者存在协同作用。

总结讨论部分：本研究表明SHLD2缺失是Polθi联合RT的合成脆弱性，可作为一种生物标志物用于前列腺癌患者分层。SHLD2缺失常伴随PTEN缺失，但Polθi放射增敏效应独立于PTEN状态。机制上，SHLD2缺失增加RT后对Polθ的依赖性，通过不依赖MRE11/CtIP切除的补偿途径限制DSB积累和染色体不稳定性。该发现拓展了Polθi在HR功能完整肿瘤中的应用前景，并支持其临床转化。研究结论翻译如下：总而言之，研究人员证明SHLD2缺失增加癌细胞对Polθi放射增敏效应的易感性。SHLD2缺失可作为选择最可能从Polθi联合RT中获益的前列腺癌患者的生物标志物。这种脆弱性反映了SHLD2缺失细胞对Polθ的依赖性增强，在此情境下，Polθ通过不依赖MRE11/CtIP介导的末端切除机制，防止DSB积累并维持染色体稳定性。这些发现支持针对SHLD2缺失肿瘤患者开展该联合策略的临床研究。