鲍曼不动杆菌噬菌体劫持2′,3′-cNMPs（2′,3′-环核苷酸单磷酸）以增强转座酶介导的噬菌体DNA整合

《SCIENCE ADVANCES》：Bacteriophages hijack 2′,3′-cNMPs to enhance transposase-mediated phage DNA integration in Acinetobacter baumannii

　　

核苷酸第二信使（nucleotide second messengers, NSMs）广泛参与细菌生理调节及抗噬菌体免疫，植物中已证实2′,3′-cAMP/2′,3′-cGMP合成酶活性是免疫应答所必需，但2′,3′-cNMPs是否参与细菌与噬菌体的互作尚不清楚。本研究发现，由RnaA合成、经A1S_2339、A1S_0249和A1S_2666降解的2′,3′-cNMPs在鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）生理调控中发挥关键作用；2′,3′-cNMPs特异性结合鲍曼不动杆菌内受体蛋白CRPAb（cAMP receptor protein of A. baumannii），影响CRPAb与靶基因启动子的结合。此外，研究人员证实噬菌体感染可升高胞内2′,3′-cNMPs水平，上调转座酶（transposase）及Mu样整合酶（Mu-like integrase）转录从而促进噬菌体DNA整合。结果表明，2′,3′-cNMPs是调控鲍曼不动杆菌生物学功能的重要胞内信号，且可被噬菌体劫持以促进其基因组整合。

论文解读：鲍曼不动杆菌噬菌体劫持2′,3′-cNMPs以增强转座酶介导的噬菌体DNA整合

本研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。目前已知3′,5′-环核苷酸单磷酸（3′,5′-cNMPs）、环二鸟苷酸（c-di-GMP）及(p)ppGpp等核苷酸第二信使（nucleotide second messengers, NSMs）可调控细菌的毒力、生物膜形成及抗噬菌体免疫，植物中2′,3′-cNMPs参与TIR（Toll/interleukin-1 receptor）域介导的免疫，大肠杆菌中2′,3′-cNMPs由RNase I产生并经含HD或DHH域的磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）降解，并可结合核糖体影响基因表达。然而，2′,3′-cNMPs在重要院内致病菌鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中的代谢、受体及生理功能，及其在细菌—噬菌体互作中的作用均未见报道。鉴于鲍曼不动杆菌中c-di-GMP和3′,5′-cAMP已被证明调控毒力和生理，研究人员假设2′,3′-cNMPs也可能是其胞内信号分子并参与噬菌体感染过程，因此开展了本研究以阐明2′,3′-cNMPs的代谢酶、特异性受体、对细菌生理及毒力的调控作用，以及噬菌体如何利用该信号通路促进自身DNA整合建立溶原态。

主要关键技术方法：

研究人员以鲍曼不动杆菌ATCC 17978为标准菌株，采用超高效液相色谱—电喷雾电离—串联质谱（LC-ESI-MS/MS）鉴定并定量胞内2′,3′-cNMPs；通过PSI-BLAST同源搜索候选合成酶与受体，原核表达纯化RnaA（A1S_3026）、A1S_2339/A1S_0249/A1S_2666、CRP_Ab（A1S_1479）及噬菌体CI蛋白（CI_Abp），进行体外酶活与结合实验；微量热涌动（MST）和等温滴定量热法（ITC）测定蛋白—配体及蛋白—DNA/蛋白—蛋白亲和力；染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）鉴定CRP_Ab靶基因及结合基序；凝胶迁移实验（EMSA）验证CRP_Ab与启动子及TetR与启动子结合；构建ΔrnaA、Δcrp_Ab、ΔA1S_1154、ΔtetR、ΔA1S_0209/ΔA1S_0210等框内缺失突变株及回补株；用噬菌体PhabP_R1（废水分离溶原噬菌体）、Ab_SZ3、Phab24感染细菌，检测2′,3′-cNMPs水平变化、噬菌体基因组整合频率（PCR及杂交验证整合位点）、丝裂霉素C（MMC）诱导原噬菌体产量；pull-down联合LC-MS及细菌双杂交（BacTH）鉴定A1S_1154互作蛋白；RNA-seq分析ΔA1S_1154转录组差异。

研究结果

Identification of 2′,3′-cNMPs in A. baumannii

研究人员通过LC-MS/MS从鲍曼不动杆菌ATCC 17978胞内提取物中鉴定出m/z对应C₁₀H₁₃N₅O₆P[M+H]⁺（2′,3′-cAMP）、C₁₀H₁₃N₅O₇P[M+H]⁺（2′,3′-cGMP）、C₉H₁₃N₃O₇P[M+H]⁺（2′,3′-cCMP）和C₉H₁₂N₂O₈P[M+H]⁺（2′,3′-cUMP）的四种2′,3′-cNMPs，确认鲍曼不动杆菌天然产生2′,3′-cNMPs。

Metabolism and biological functions of 2′,3′-cNMPs in A. baumannii

生物信息学结合体外酶活实验表明RNase T2家族蛋白RnaA（A1S_3026）以RNA为底物催化生成四种2′,3′-cNMPs但不降解DNA；A1S_2339（HD域）、A1S_0249和A1S_2666（钙调磷酸酶样PDE域）可水解2′,3′-cNMPs为2′-AMP/3′-AMP，底物偏好不同。ΔrnaA株2′,3′-cNMPs检测不到，ΔA1S_2339/ΔA1S_0249/ΔA1S_2666株2′,3′-cNMPs升高。ΔrnaA显著降低生物膜形成及A549细胞毒性，回补恢复；Δ降解酶株表型相反。表明2′,3′-cNMPs正向调控鲍曼不动杆菌生理与致病性。

Identification of the receptor protein of 2′,3′-cNMPs in A. baumannii

MST与ITC显示CRP_Ab（A1S_1479，CRP同源蛋白）特异性结合2′,3′-cAMP（K_d=3.5±1.9 μM），较弱结合2′,3′-cGMP、2′,3′-cCMP、2′,3′-cUMP，不结合3′,5′-cAMP、3′,5′-cGMP、c-di-GMP等。点突变CRP_Ab^R153A和CRP_Ab^L187A显著削弱2′,3′-cAMP结合及表型回补能力。Δcrp_Ab表型同ΔrnaA。分子对接与分子动力学模拟表明CRP_Ab缺乏CRP_Ec结合3′,5′-cAMP所需T127/S128残基故无法结合3′,5′-cAMP。确认CRP_Ab是鲍曼不动杆菌特异性2′,3′-cNMPs效应蛋白。

CRP_Abregulates target gene expression by binding to the promoter of target genes

ChIP-seq鉴定CRP_Ab直接结合CsuA/B（A1S_2218）、菌毛蛋白（A1S_1510）及原噬菌体基因A1S_1154启动子，保守结合基序为5′-AATTGCAGCAGC-3′。EMSA证实CRP_Ab与这些启动子形成复合物，缺失结合基序则无结合。RT-qPCR与lacZ报告基因显示Δcrp_Ab中A1S_2218、A1S_1510、A1S_1154转录显著下调。说明CRP_Ab通过直接结合靶启动子调控包括原噬菌体基因在内的靶基因表达。

2′,3′-cNMPs enhance the binding of CRP_Abto target promoter DNA

EMSA中加入2′,3′-cAMP（及其他2′,3′-cNMPs）明显增强CRP_Ab与A1S_1154启动子探针的结合；CRP_Ab^R153A/CRP_Ab^L187A突变体无此增强效应。表明2′,3′-cNMPs结合CRP_Ab后提高其DNA结合亲和力从而激活靶基因转录。

Bacteriophages elevate the intracellular levels of 2′,3′-cNMPs to enhance phage DNA integration

噬菌体PhabP_R1感染使胞内2′,3′-cNMPs升高，rnaA转录不变但降解酶编码基因A1S_2339、A1S_0249转录下调，其中A1S_0249下调最显著。筛选噬菌体基因组发现PhabP_R1基因28编码CI阻遏蛋白（CI_Abp，LexA家族）可最强抑制A1S_0249转录。纯化CI_Abp直接结合A1S_0249启动子（MST、EMSA），过表达CI_Abp降低A1S_0249蛋白量并使2′,3′-cNMPs升高。Southern杂交确定PhabP_R1整合入ATCC 17978基因组（A1S_2030及A1S_2022位点），ΔrnaA与Δcrp_Ab整合频率及MMC诱导噬菌体产量均下降，回补恢复。说明噬菌体通过CI_Abp抑制2′,3′-cNMP降解酶表达使胞内2′,3′-cNMPs累积，激活CRP_Ab依赖的整合相关基因表达促进溶原整合。

A1S_1154 is a downstream component of the 2′,3′-cNMPs/CRP_Absignaling pathway

ΔA1S_1154整合频率降低，影响生物膜与细胞毒性。RNA-seq显示ΔA1S_1154中IS481家族转座酶A1S_0209（A1S_0209）与Mu样整合酶A1S_0210（A1S_0210）共转录本下调，过表达A1S_0209/A1S_0210或回补A1S_1154可恢复整合频率，ΔA1S_0209/ΔA1S_0210整合缺陷同ΔA1S_1154。表明A1S_1154为2′,3′-cNMPs/CRP_Ab通路下游组分，通过正调控A1S_0209/A1S_0210促进噬菌体DNA整合。

A1S_1154 reverses the regulatory effect of A1S_2042 (TetR) on the transcription of A1S_0209 and A1S_0210

Pull-down与LC-MS鉴定A1S_1154互作TetR家族转录因子A1S_2042（TetR），BacTH与MST确认互作（K_d≈0.162 μM）。ΔtetR整合频率升高、A1S_0209转录上调，TetR直接结合A1S_0209启动子抑制其转录。A1S_1154过表达减弱TetR二聚化（BacTH与MST）并削弱TetR与A1S_0209启动子结合（EMSA）。A1S_1154点突变R34A/R42A丧失与TetR互作及解除TetR抑制的能力。表明A1S_1154结合并破坏TetR二聚体，解除TetR对转座酶/整合酶编码基因A1S_0209/A1S_0210的转录抑制。

讨论（结论部分翻译总结）：

研究人员证实鲍曼不动杆菌中RnaA合成2′,3′-cNMPs，A1S_2339、A1S_0249、A1S_2666降解之；2′,3′-cNMPs通过其特异性受体CRP_Ab（不结合3′,5′-cAMP）激活靶基因包括原噬菌体基因A1S_1154的转录；噬菌体感染时噬菌体CI阻遏蛋白抑制A1S_0249等降解酶基因转录使胞内2′,3′-cNMPs累积，CRP_Ab被活化而上调A1S_1154；A1S_1154结合并破坏TetR二聚体解除其对A1S_0209（IS481家族转座酶）与A1S_0210（Mu样整合酶）的抑制，从而促进噬菌体DNA整合建立溶原。本研究首次揭示2′,3′-cNMPs在细菌—噬菌体互作中被噬菌体劫持利用的分子机制，拓展了对细菌第二信使功能及噬菌体溶原化调控的认识，CRP_Ab同源蛋白在不同病原菌中可能普遍存在类似2′,3′-cNMP信号系统。