再生性巨噬细胞增强干细胞来源的β细胞功能和植入

《SCIENCE ADVANCES》：Regenerative macrophages enhance stem cell–derived β cell function and engraftment

　　

从人胚胎或诱导多能干细胞生成产生胰岛素的干细胞来源β细胞（SC-β细胞）为治疗1型糖尿病带来了希望。SC-β细胞的移植已在临床测试中，但生成具有与内源性细胞相似胰岛素分泌特性的成熟细胞仍具挑战性。鉴于巨噬细胞对于胰岛发育至关重要，研究人员假设它们可以增强SC-β细胞的分化和功能。研究人员在SC-β细胞分化的第7阶段，将自体SC-巨噬细胞（SC-M）与SC-β细胞共聚集，这些巨噬细胞要么是非极化的（SC-M_Unp），要么是极化为炎症型（SC-M_Inf）或再生型（SC-M_Reg）状态。SC-M_Reg改善了SC-β细胞的成熟标志物表达、葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）和代谢活性。将SC-β细胞与SC-M_Reg共聚集后移植到糖尿病小鼠体内，与单独移植SC-β细胞相比，能显著更快地使血糖正常化。在SC-β分化过程中添加巨噬细胞可加速功能成熟这一发现，是生产SC-β细胞作为1型糖尿病再生细胞疗法的一个显著进展。

**研究背景与问题**
1型糖尿病（T1D）是一种慢性自身免疫性疾病，由胰岛中产生胰岛素的β细胞被破坏导致，患者需依赖外源性胰岛素维持血糖。尽管胰岛素治疗可挽救生命，但无法完全避免视网膜病变、肾病及心血管疾病等长期并发症，且部分患者仍面临严重低血糖风险。胰岛移植（如埃德蒙顿方案）虽能恢复内源性胰岛素分泌，但受限于供体胰腺稀缺及终身免疫抑制带来的癌症、感染等副作用。近年来，人多能干细胞（hPSC）分化产生的干细胞来源β细胞（SC-β细胞）有望成为无限细胞来源，然而现有分化方案生成的SC-β细胞功能不成熟——胰岛素分泌能力欠佳、线粒体功能受损且移植后存活率低。巨噬细胞在胚胎胰岛发育中起关键作用，包括组织重塑、营养支持和清除凋亡细胞，但在SC-β细胞分化过程中通常被忽略。研究人员假设，在分化中添加巨噬细胞可模拟体内微环境，促进SC-β细胞成熟。

**研究目的与结论**
研究人员建立共聚集系统，在SC-β细胞分化第7阶段（S7）加入自体SC-巨噬细胞（SC-M），并比较非极化（SC-M_Unp）、炎症型（SC-M_Inf）和再生型（SC-M_Reg）的影响。结果发现，SC-M_Reg显著提升SC-β细胞的成熟标志物（如INS、PDX1）表达、葡萄糖刺激的C肽分泌及代谢活性。将共聚集体移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病免疫缺陷小鼠眼前房（ACE）后，SC-β+SC-M_Reg组在30天内全部达到稳定血糖正常化，比单独SC-β组快4周，并改善餐后血糖控制和人C肽水平。该研究证明再生型巨噬细胞能加速SC-β细胞功能成熟，为T1D再生细胞疗法提供重要改进策略。论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。

**主要关键技术方法**（不超过250字）
1. **CRISPR基因编辑**：在WA01 H1人胚胎干细胞（hESC）的CD68基因座敲入IRES-mScarlet报告基因，实现巨噬细胞活细胞成像。
2. **巨噬细胞分化与极化**：采用四步无饲养层方案从hESC生成原始巨噬细胞，再用脂多糖（LPS）+干扰素-γ（IFN-γ）极化至炎症型（SC-M_Inf），或用白细胞介素-4（IL-4）+IL-13极化至再生型（SC-M_Reg）。
3. **SC-β细胞分化与共聚集**：从INS-GFP hESC系经七步方案分化至S7，GFP分选后与SC-M以3%比例在AggreWell板中共培养（Matrigel辅助聚合），随后在低黏附摇瓶中形成球体。
4. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）**：解离共聚集体后磁珠富集CD45+细胞，使用10x Genomics平台建库测序，Seurat分析细胞亚群、差异基因及配体-受体相互作用。
5. **移植模型**：将共聚集体移植到STZ诱导轻度糖尿病的雌性SCID-Beige小鼠眼前房，每周监测随机血糖、空腹/再进食后血糖及人C肽（ELISA）。
样本来源：WA01 H1 hESC系（WiCell）。

**研究结果**
**1. 生成CD68-mScarlet人胚胎干细胞来源巨噬细胞**
通过CRISPR构建CD68-mScarlet报告hESC系，分化的SC-M表达巨噬细胞标志物CD45、CD14、CD68。SC-M_Inf上调CD80，分泌促炎因子IL-6、TNFα、IL-1β、CXCL10；SC-M_Reg上调CD206，分泌抗炎因子IL-10、CCL17。所有亚型均具备吞噬能力，SC-M_Reg荧光强度最高。结论：SC-M功能表型类似原代巨噬细胞。

**2. 与SC-β细胞共聚集促使SC-M转向再生表型**
流式细胞术显示，SC-M_Reg与SC-β共培养后CD206升高；SC-M_Unp和SC-M_Inf的CD80降低。多重细胞因子分析表明，所有SC-M均上调IL-1RA，SC-M_Inf的TNFα、IL-6、CXCL10下降。结论：SC-β细胞微环境将巨噬细胞重编程为抗炎/再生表型。

**3. SC-M_Reg在共聚集1周后改善SC-β细胞成熟与功能**
共聚焦成像显示SC-M主要分布于球体外周，且含SC-M的球体更小。流式细胞术表明SC-M_Inf或SC-M_Reg增加INS-GFP/IAPP-mScarlet双阳性细胞比例。qPCR证实SC-M_Inf/SC-M_Reg上调INS和PDX1表达。静态GSIS实验显示，SC-M_Reg共聚集显著提高葡萄糖刺激的C肽分泌，降低KCl刺激的分泌，总C肽含量不变。条件培养基实验表明分泌因子部分介导该效应。结论：再生巨噬细胞通过直接接触和旁分泌因子增强SC-β细胞的功能成熟。

**4. 单细胞转录组揭示SC-M_Reg驱动SC-β细胞代谢活性提升**
scRNA-seq分析17,576个细胞，鉴定出SC-β、SC-α、SC-δ、未成熟β样、α谱系内分泌祖细胞（ENP-α）及两种肠嗜铬样细胞（SC-EC1/SC-EC2）。共聚集后成熟α和β细胞比例分别增加1.2倍和3倍，EC细胞比例下降。CellChat分析显示SC-M_Reg主要通过IGF1、GRN、TGFβ等再生相关因子与SC-β细胞通讯。通路富集分析揭示氧化磷酸化、电子传递链、ATP合成等代谢通路显著上调。SCENITH实验证实共聚集后SC-β细胞糖酵解依赖性和氧化磷酸化活性增强。结论：再生巨噬细胞通过促进代谢成熟改善SC-β细胞葡萄糖响应能力。

**5. SC-β细胞-SC-M_Reg共聚集体使高血糖小鼠血糖正常化**
移植后30天内，SC-β+SC-M_Reg组全部实现稳定血糖正常化（随机血糖<11.1 mM持续2周），而单独SC-β组需近60天。1个月后再进食试验显示SC-β+SC-M_Reg组血糖控制和人C肽水平显著优于其他组。SC-M_Unp或SC-M_Inf共移植无额外获益。结论：再生巨噬细胞加速SC-β细胞体内功能整合，促进糖尿病逆转。

**总结与讨论**
该项研究证明了再生型巨噬细胞（SC-M_Reg）可通过改善代谢通路（糖酵解、氧化磷酸化）和旁分泌IGF1等因子，显著提升SC-β细胞的体外成熟度与葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并在移植后迅速实现血糖正常化。这一策略弥补了当前SC-β分化方案中缺乏免疫细胞的缺陷，为生产功能接近原代人胰岛的SC-β细胞提供了可行方案。SC-M_Reg作为细胞辅剂有望提高干细胞来源β细胞替代疗法的疗效。研究局限性包括：未完全阐明潜在机制；仅使用单一小鼠模型（SCID.Beige）和移植部位（眼前房）；未检测雄性小鼠或更严格糖尿病模型中的疗效。

**研究结论（翻译）**
“产生功能性SC-β细胞的策略仍在持续推进。本研究表明，再生型巨噬细胞可改善SC-β细胞的代谢功能，加速移植后的功能整合，并提升血糖控制效果，推动该领域向生产功能与原代人胰岛相当的SC-β细胞迈进。鉴于其对移植物性能的实质性影响，SC-M_Reg代表了一种有前景的细胞辅剂，可提高基于干细胞的β细胞替代疗法的有效性。”