伊立替康调节神经母细胞瘤中的免疫检查点

《ImmunoTargets and Therapy》：Irinotecan Modulates Immune Checkpoints in Neuroblastoma

　　

摘要
背景：神经母细胞瘤（NBL）是儿童最常见的颅外实体肿瘤，高危病例的生存率为50%。化疗联合免疫疗法是高危NBL（HR-NBL）治疗的核心。
目的：本研究旨在探索伊立替康如何影响NBL细胞的免疫景观，特别关注与未来化疗-免疫治疗策略相关的免疫检查点的调节。
方法：将两种神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE(2)和SH-SY5Y暴露于亚致死剂量的伊立替康和IFN-γ中。流式细胞术评估了包括GD2、CD47、MHC I和PD-L1在内的免疫标志物的表达。研究人员还检测了巨噬细胞的吞噬作用和T细胞介导的杀伤作用。利用神经母细胞瘤小鼠模型进行的体内研究评估了伊立替康和PBMC注射的效果。还在细胞培养上清液和探索性患者血浆样本中测量了可溶性CD47。
结果：处理暴露与多种免疫相关标志物（包括GD2、CD47、PD-L1和MHC I类分子）的调节相关。虽然伊立替康降低了巨噬细胞介导的吞噬作用，但这一效应可通过添加抗CD47抗体而逆转。当NBL细胞预先用伊立替康处理后，T细胞介导的杀伤作用增强。体内研究表明，与单独治疗相比，PBMCs与伊立替康联合使用可降低肿瘤负荷。此外，在患者血浆中可检测到CD47表达，提示可溶性CD47值得在未来更大规模的队列中探索。
结论：这项初步研究表明，伊立替康可能调节神经母细胞瘤中的关键免疫检查点。这些结果支持进一步研究合理的化疗-免疫治疗联合策略，包括针对GD2和CD47的联合策略。
关键词：神经母细胞瘤；化疗；免疫疗法；伊立替康；CD47

**论文解读：伊立替康调节神经母细胞瘤免疫检查点的探索性研究**

**研究背景与问题**

神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NBL）是儿童最常见的颅外实体肿瘤，高危病例的5年总生存率仍仅约50%。尽管多模式治疗（包括强化化疗、手术、放疗、自体干细胞移植、分化治疗及抗GD2免疫治疗）已成为高危NBL（HR-NBL）的标准治疗方案，但复发和难治性疾病仍是主要临床挑战。值得注意的是，NBL被视为免疫学上的“冷”肿瘤，其特征为肿瘤微环境（Tumor Microenvironment，TME）中活化免疫细胞浸润有限，且免疫检查点抑制剂在NBL中尚未取得在部分成人癌症中的成功。化疗与免疫治疗的联合方案正在NBL临床试验中探索，但化疗对存活的NBL细胞免疫特性的具体影响尚不明确。伊立替康（Irinotecan）是一种拓扑异构酶I抑制剂，广泛用于复发/难治性NBL，并在其他肿瘤模型中显示出调节免疫环境的潜力，但其在NBL中的免疫调节效应尚未充分表征。因此，研究人员开展了这项初步探索性研究，旨在探讨伊立替康如何影响NBL细胞的免疫景观，重点关注与未来化疗-免疫治疗策略相关的免疫检查点调节。该论文发表在《ImmunoTargets and Therapy》上。

**主要关键技术与方法**

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1）**体外细胞模型**：使用两种NBL细胞系SK-N-BE(2)和SH-SY5Y，暴露于亚致死剂量伊立替康和干扰素-γ（IFN-γ）；2）**流式细胞术**：评估免疫标志物GD2、CD47、MHC I类分子和PD-L1的表达；3）**功能测定**：通过巨噬细胞吞噬作用测定和T细胞介导杀伤实验评估免疫效应细胞功能；4）**体内模型**：在NSG小鼠中建立人源化NBL腹腔（IP）移植模型，并给予外周血单核细胞（PBMCs）和/或伊立替康治疗；5）**酶联免疫吸附试验（ELISA）**：检测细胞培养上清液和5例NBL患者血浆中的可溶性CD47（sCD47）；6）**免疫组织化学（IHC）**：采用商业组织微阵列（27例NBL样本及5例外周神经组织）评估CD47表达。

**研究结果**

**1. 伊立替康和IFN-γ调节神经母细胞瘤细胞免疫检查点表达**
研究人员通过活细胞成像系统确定亚致死剂量（1μM伊立替康，维持≥70%细胞活力）。流式细胞术结果显示：GD2在SK-N-BE(2)细胞中高表达，伊立替康可进一步上调其表达；PD-L1基线水平较低，伊立替康或IFN-γ处理呈时间依赖性上调PD-L1，联合处理进一步升高；CD47基线水平高，伊立替康或IFN-γ单独处理增加其表达，联合处理产生最高水平；MHC I类分子基线低，IFN-γ显著上调，联合伊立替康产生加性效应。

**2. 伊立替康干扰吞噬作用，抗CD47抗体可逆转该效应**
巨噬细胞吞噬实验发现，与预期相反，亚致死伊立替康处理NBL细胞后，巨噬细胞吞噬活性降低（图2A）。添加抗CD47抗体（αCD47）后，巨噬细胞吞噬效率显著升高（图2C），且αCD47与伊立替康联合产生最显著的吞噬活性（图2B、2C）。这表明CD47上调是伊立替康诱导免疫逃逸的潜在机制。

**3. 活化T细胞与伊立替康联合增强神经母细胞瘤细胞杀伤**
在T细胞介导的细胞毒性实验中，仅活化T细胞与NBL细胞共培养未产生显著杀伤，而预先用亚致死伊立替康处理NBL细胞后，T细胞杀伤作用显著增强（图3）。研究人员推测这与伊立替康联合T细胞活化后IFN-γ分泌增加、进而上调MHC I类分子有关。

**4. 患者肿瘤组织CD47免疫染色显示可变过表达**
通过对NBL患者基线肿瘤组织微阵列的免疫组化分析发现，相对于正常外周神经组织（评分为0），NBL肿瘤组织CD47显著过表达，且表达强度呈部位依赖性：肾上腺来源的NBL均显示最强染色（评分3），纵隔和腹膜后样本评分可变。

**5. CD47可能从NBL细胞脱落至周围环境**
ELISA检测显示，在SH-SY5Y细胞培养上清液中可检测到可溶性CD47，且伊立替康和IFN-γ处理进一步升高其水平（图5A）。在5例NBL患者血浆中也检测到可溶性CD47（图5B），其中1例复发治疗前无法检测、治疗后出现低水平信号，提示sCD47可能具有诊断标志物潜力。

**6. NBL人源化小鼠模型中PBMCs与伊立替康联合有效清除肿瘤**
在NSG小鼠IP移植模型中，PBMCs单独注射显著降低肿瘤信号，伊立替康单独治疗效果有限，而PBMCs与伊立替康联合组在选定时间点肿瘤负荷最低且呈更持续抑制趋势（图6）。脾脏分析显示，联合治疗组脾脏重量最大，人CD45+白细胞约占20%，其中人T细胞约占10-15%，CD8+效应T细胞占T细胞的约40%（图7），提示CD8+ T细胞参与肿瘤清除。

**总结讨论与结论**

研究人员在讨论部分指出，该探索性研究发现伊立替康可调节NBL细胞上多种免疫相关通路，包括上调GD2、PD-L1、CD47和MHC I类分子。其中，CD47作为“不要吃我”信号的上调可能是化疗后免疫逃逸的补偿机制，但抗CD47抗体可有效恢复巨噬细胞吞噬功能，提示联合靶向CD47-SIRPα轴的治疗策略具有潜力。T细胞杀伤实验表明伊立替康预处理可增强T细胞介导的细胞毒性，尽管PD-L1上调，但单独PD-1/PD-L1抑制在NBL中效果有限，需要联合策略改善免疫微环境。体内模型进一步支持PBMCs与伊立替康联合治疗的有效性，且脾脏中CD8+ T细胞募集增加。可溶性CD47在患者血浆中的检出提示其作为循环生物标志物的可行性。

研究结论部分翻译如下：这项初步探索性研究表明，伊立替康可能影响神经母细胞瘤中的若干免疫相关通路，包括检查点表达以及与先天性和适应性免疫细胞的相互作用。这些初步发现支持未来在神经母细胞瘤研究中进一步开展关于化疗-免疫治疗联合策略及靶向CD47策略的机制性研究。