基于抗体-寡核苷酸结合物与RCA/Cas12a系统的阿尔茨海默病血液中p-tau217的超灵敏检测方法

《Analytica Chimica Acta》：Ultrasensitive detection of blood-based p-tau217 for Alzheimer's disease integrated antibody-oligonucleotide conjugates and RCA/Cas12a system

　　

余晨|张博文|杨松|王平|王旭德|何汉平

中国湖北省传统中药生物技术重点实验室，湖北大学健康科学与工程学院，武汉，430062，中国

摘要：

在阿尔茨海默病诊断领域，酪氨酸217位点磷酸化的tau蛋白（p-tau217）作为“关键生物标志物”越来越受到关注，因为它在检测阿尔茨海默病病理变化及预测未来认知功能下降方面具有最高的准确性。在此，我们开发了一种基于血液的超微量p-tau217检测平台，名为磁粒子免疫滚环扩增/Cas12a检测法（MPIRCA）。该检测方法包括两个主要步骤：首先是All@MP准备阶段，包括抗体固定、捕获和结合；其次是单锅式RCA/Cas12a反应。通过Ab-DNA技术，免疫检测被成功转化为基于DNA的分子检测技术，从而实现了极高的灵敏度，检测下限可达1fg/mL。经过优化的检测方法在1fg/mL到1ng/mL的范围内具有出色的线性关系。这项研究提出了一种高效的检测策略，结合了单锅操作、高灵敏度和高选择性，为阿尔茨海默病的血液检测和管理带来了巨大潜力。

引言

随着全球人口老龄化趋势的加剧，阿尔茨海默病的患病率显著上升，给社会带来了诸多问题^[1]。目前，阿尔茨海默病的金标准诊断方法是正电子发射断层扫描和脑脊液分析。其中，PET成像成本极高；而传统的腰椎穿刺脑脊液采样方法则具有侵入性且会给患者带来极大痛苦。此外，这些技术的临床应用还受到诸多因素的限制，比如检测条件等。轻度患者及有患病风险的患者往往不愿接受此类检查，因此这两种方法都不适合大规模推广。

包括Aβ40、Aβ42以及磷酸化tau蛋白在内的血液生物标志物，其诊断性能与美国食品药品监督管理局认可的脑脊液生物标志物相当，是一种更具无创性且更易推广的替代方案^[2]。由于血液生物标志物有助于简化临床实践并提高检测准确性，因此越来越多的人开始关注将其用于阿尔茨海默病诊断。不过，这些生物标志物在血液中的浓度极低，通常仅为fg/mL级别，甚至更低，大约是脑脊液中浓度的1/10或更低^[3]、^[4]。如此低的浓度使得在血液检测中实现高特异性和高准确性变得极为困难。在各种tau蛋白变体中，酪氨酸217位点磷酸化的tau蛋白（p-tau217）在检测阿尔茨海默病病理变化及预测未来认知功能下降方面具有最高的准确性^[5]、^[6]。例如，p-tau217有助于区分阿尔茨海默病与非阿尔茨海默病导致的认知障碍，其对所有原因引起的痴呆症的诊断准确率约为81%，这一数值高于其对纯阿尔茨海默病的诊断准确率^[7]。据报道，脑脊液中的p-tau217浓度约为101.95pg/mL，而血液中的浓度则要低得多，仅为约6.56pg/mL^[8]。常见的临床免疫检测方法——磁粒子化学发光免疫测定法，难以满足阿尔茨海默病血液检测的需求。目前也有一些高灵敏度的检测技术被用于阿尔茨海默病诊断，比如单分子阵列技术^[9]、介观尺度检测技术^[10]、免疫沉淀质谱技术^[11]以及olink蛋白质组学技术^[12]。然而，这些技术要么成本过高，要么灵敏度不足。目前还没有一种成熟的临床方法能够全面检测阿尔茨海默病的血液生物标志物。因此，迫切需要开发出高灵敏度、高选择性、低成本且稳定的血液检测方法，以便更广泛地用于阿尔茨海默病的诊断^[13]。

通常，抗原检测依赖于使用标记抗体的免疫检测方法。在酶联免疫吸附试验中^[14]、^[15]，通过使用酶标记的抗体可以提高检测灵敏度，但酶本身的不稳定性和安全性问题限制了其应用。虽然直接将化学发光或荧光探针与抗体结合可以提升稳定性，但由于缺乏内在的信号放大机制，很难达到检测超微量阿尔茨海默病生物标志物所需的灵敏度^[16]、^[17]。抗体-寡核苷酸结合物则是一种创新的试剂类型，它兼具抗体的特异性结合能力与寡核苷酸的功能特性，因而同时具有抗体和核酸的双重特点^[19]。核酸的指数级放大能力为实现超灵敏检测提供了可能^[20]。免疫聚合酶链反应和邻近连接反应等技术将免疫检测与核酸放大相结合，从而降低了检测限。此外，抗体-寡核苷酸结合物还可以与其他放大技术结合使用，比如环介导等温扩增技术和重组酶聚合酶扩增技术^[22]、^[23]。尽管这些方法具有很高的灵敏度和特异性，但仍然存在一些固有缺陷，比如对温度要求较高、引物设计复杂或易出现非特异性扩增等问题^[24]。而RCA则是一种高效的酶促等温反应，它以环形探针为模板，在短DNA引物的作用下产生长链单链DNA产物，由于其高效、简单且用途广泛，因此成为生物检测和分析领域的理想工具^[25]。

CRISPR/Cas系统因其基因编辑功能而广为人知^[26]、^[27]，近年来，由于其单碱基识别能力和出色的信号放大能力，它也逐渐成为一种强大的生物传感工具^[28]、^[29]。这一特性使得目标识别与信号放大能够同步进行。近年来，基于CRISPR/Cas12a的核酸检测生物传感器取得了显著进展^[30]，引起了众多人对高灵敏度检测平台的兴趣^[31]。为了进一步提升对超微量目标的检测灵敏度，人们常常将Cas12a与各种放大技术结合使用^[32]、^[33]，比如RCA-Cas12a^[34]、^[35]、LAMP-Cas12a^[36]、^[37]、RPA-Cas12a^[38]以及级联放大技术^[39]。其中，滚环扩增技术是一种可靠且高效的等温核酸扩增方法，可在较低温度下进行操作。由于环形DNA模板与滚环扩增技术非常匹配，因此该技术特别适用于检测单链核酸目标^[40]。因此，将RCA与Cas12a-CRISPR技术相结合的双信号放大策略，能够实现对阿尔茨海默病生物标志物的精准检测。

在本研究中，为了检测阿尔茨海默病患者血液样本中的超微量生物标志物p-tau217，我们开发了一种名为磁粒子免疫滚环扩增-Cas12a检测法（MPIRCA）的简易检测平台。磁粒子具有诸多优势，尤其便于实现洗涤和分离操作，从而提升了检测方法的灵敏度和特异性^[41]、^[42]。通过利用抗体-寡核苷酸结合物的双重功能，它们起到了连接免疫检测与后续分子检测的作用，从而使免疫检测成功转化为基于DNA的分子检测技术。重要的是，这种分子检测技术将滚环扩增技术与CRISPR-Cas12a技术相结合，通过滚环扩增产生的产物触发CRISPR/Cas12a的切割活性，进而产生荧光信号。经过优化的单锅式RCA/Cas12a系统消除了单独进行扩增和切割的多步骤流程，还能重复利用扩增产物作为引物，从而充分发挥Cas12a的协同作用。MPIRCA方法对p-tau217的检测下限可低至1fg/mL，且在1fg/mL到1ng/mL的范围内具有出色的线性关系，同时在人类血清检测中也表现出较高的准确性。这些研究为阿尔茨海默病血液生物标志物的超微量检测提供了一种有效的策略。

章节节选

试剂与材料

所有的DNA单链均由上海桑格生物技术公司合成，并通过高效液相色谱法进行纯化。所有序列详见表S1。过硫酸铵、氯化钠、二甲基亚砜、醋酸、乙醇均购自上海华药化学试剂有限公司。1M Tris-HCl（pH 7.4）、GelRed、30%丙烯酰胺、DNA标记物、5倍非还原性蛋白质上样缓冲液、6倍DNA上样缓冲液、T4 DNA连接酶、Phi29菌株

MPIRCA平台的设计原理

MPIRCA平台将基于免疫检测的检测方法转化为基于DNA的分子诊断方法，用于检测血液中的p-tau217。该方法利用带DNA标签的抗体，结合磁粒子介导的分离和富集技术，以及RCA和CRISPR/Cas12a驱动的荧光信号输出，从而实现高灵敏度检测（All@MP + RCA/Cas12a）。具体的实验步骤如下（见图1）：

• (1)
  固定化：使用磁粒子将p-tau217抗体固定下来，

结论

总之，我们基于磁粒子构建了一种超灵敏的MPIRCA平台，可用于检测血液中的p-tau217，其检测下限可达1fg/mL。我们制备了抗体-寡核苷酸结合物，从而成功地将基于免疫检测的检测方法转化为基于DNA的分子诊断方法。在分子诊断过程中，我们采用了RCA和Cas12a反应的单锅式策略，以实现高特异性和超微量检测。MPIRCA方法表现出了

CRediT作者贡献说明

王旭德：指导工作、项目管理、实验研究、资金获取。何汉平：论文撰写与修改、指导工作、项目管理、方法设计、实验研究、资金获取。余晨：论文初稿撰写、数据可视化、结果验证、软件应用、项目管理、方法设计、正式分析、数据整理、概念构思。张博文：数据可视化、软件应用、方法设计、正式分析、数据整理、概念构思。杨松：软件应用，

利益冲突声明

作者们声明不存在任何利益冲突。

利益冲突声明

? 作者们声明自己没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金的支持（项目编号：52171177）。