在线HILIC-ESI-HRMS与ICP-MS soybean/s su /sub> 和ICP-MS soy/sub> /sub>联用技术对铜纳米颗粒暴露下转基因大豆愈伤组织的化学物种进行综合分析

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Integrated online HILIC-ESI-HRMS and ICP-MS/MS for chemical species profiling in transgenic soybean callus exposed to copper nanoparticles

　　

大豆愈伤组织是研究外部胁迫因子引发生化和元素响应的稳健体外模型。在本研究中，研究人员将转基因大豆（Glycine max）愈伤组织暴露于递增浓度的铜纳米颗粒（CuNPs; 10、50和100 μg L^-1），并利用在线联用的亲水相互作用色谱-电喷雾电离-高分辨质谱-电感耦合等离子体串联质谱（HILIC-ESI-HRMS-ICP-MS/MS）平台对其化学响应进行了研究。这种联用分析方法实现了共流出化学物种的同步色谱分离、分子表征和元素检测，在单一分析工作流程中提供了互补的代谢组学和形态学信息。在线联用揭示了显著的浓度依赖性效应：暴露于10和50 μg L^-1 CuNPs的愈伤组织较100 μg L^-1组表现出降低的化学多样性。多变量分析和通路水平分析表明，CuNP暴露逐步重塑了代谢景观，最高浓度下观察到最显著的代谢改变。这些变化主要与细胞防御响应、氧化还原失衡和膜重塑相关，证据包括氧化脂类（oxylipins）和溶血磷脂酰胆碱（lysophospholipids）的积累增加，如12(13)-Ep-9-KODE、(9Z,12Z)-7,8,16-三羟基十八碳-9,12-二烯酸和LysoPC(16:0/0:0)。重要的是，由在线HILIC-ESI-HRMS-ICP-MS/MS平台提供的整合物种组学（speciomics）策略使得金属和杂原子含物种的推定注释成为可能，提示涉及锰（Mn）、镁（Mg）、锌（Zn）、磷（P）和硫（S）等必需元素与有机配体结合的稳态调整。这些发现凸显了元素再分布和配位化学在塑造大豆愈伤组织对纳米颗粒诱导胁迫的生化响应中的核心作用，并展示了整合分子与元素检测用于研究复杂生物系统的分析潜力。

**研究背景与问题提出**

现代农业日益依赖技术创新以平衡生产力与环境胁迫缓解，特别是在大豆等高投入种植系统中。在此背景下，植物生物技术和体外培养系统已成为研究细胞对环境刺激响应及推进精准农业策略的重要实验平台。大豆（Glycine max）作为全球最重要的经济作物之一，其高度动态的代谢在胁迫耐受、氧化还原调控和生产力方面发挥着核心作用。转基因大豆愈伤组织具有遗传改良的代谢背景，为研究植物代谢如何响应外部扰动提供了宝贵系统。

近年来，农业研究对纳米技术的兴趣日益增长，特别是金属纳米颗粒作为抗菌剂、生长调节剂和植物胁迫响应调节剂的应用。其中，铜纳米颗粒（CuNPs）因铜在植物代谢、氧化还原稳态和酶活性中的重要作用而备受关注。尽管CuNPs应用前景广阔，但纳米颗粒在植物系统中的行为、转化和生物效应仍认识不足，尤其关于其化学形态及与内源性生物分子的相互作用。愈伤组织培养是研究胁迫诱导代谢重编程的稳健体外模型，但目前将植物愈伤组织培养与金属纳米颗粒暴露相结合、同时解决化学形态和分子水平转化的研究仍十分缺乏。现有研究多孤立地依赖分子或元素分析，限制了纳米颗粒诱导生化响应的解读。

**技术方法与平台构建**

为克服上述局限，研究人员采用在线联用HILIC-ESI-HRMS与ICP-MS/MS的多维分析平台。该联用系统通过流速分配器将色谱流出液按70:30分流至ESI-HRMS和ICP-MS/MS，实现同步色谱分离、平行分子鉴定与元素检测。研究使用反枝农杆菌（Roundup Ready）转基因大豆种子（携带cp4-EPSPS转基因）建立愈伤组织培养体系，设置10、50和100 μg L^-1三个CuNP暴露浓度及对照组，培养30天后取样分析。色谱分离采用Accucore Amide-HILIC柱，HRMS在正负离子模式下进行全扫描及数据依赖的二级质谱采集，ICP-MS/MS采用O₂和H₂为反应气体检测Fe、Cu、Zn、Mo、Ni、Mg、Mn、Ca、S、P等元素。数据分析采用Compound Discoverer进行化合物鉴定，MetaboAnalyst 6.0进行主成分分析（PCA）。

**研究结果分析**

**愈伤组织培养评估**：经30天培养，所有处理组愈伤组织均呈现正常生长和健康绿色，无可见氧化胁迫症状或生长抑制，表明CuNP诱导响应主要发生在分子和代谢水平，而非宏观生理层面。

**化学物种多变量分析**：PCA模型显示PC1和PC2分别解释40.2%和37.2%的方差。对照组位于PC1和PC2负区域；10 μg L^-1组沿正PC2分布但接近PC1原点，提示早期适应性代谢调整；50 μg L^-1组处于中间位置；100 μg L^-1组形成明显独立的簇，显示显著且质上不同的代谢状态。PC1正载荷与γ-氨基丁酸（GABA)、谷氨酰谷氨酸（Glu-Gln）、谷氨酰天冬氨酸（Glu-Asp）及苯丙素类化合物等胁迫防御相关代谢物相关；负载荷与L-谷氨酸等基础代谢物相关。PC2负载荷由12-氧-植物二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid）主导，其与100 μg L^-1组紧密关联，提示脂质衍生信号通路激活和更严重氧化胁迫。

**化学物种多样性与组成趋势**：对照组鉴定118个物种，10和50 μg L^-1组分别降至96和94个，100 μg L^-1组增至122个，呈非线性浓度依赖模式。氨基酸、碳水化合物和莽草酸相关化合物为最主要类别，在10和50 μg L^-1降低而在100 μg L^-1升高。

**CuNP诱导的代谢途径响应**：100 μg L^-1组脂质代谢显著改变，出现13(S)-HOTrE、(6E,8E)-5,10-二氧代十八碳-6,8-二烯酸和(9Z,12Z)-7,8,16-三羟基十八碳-9,12-二烯酸等高度氧化的脂肪酸衍生物，标志脂质过氧化和膜氧化。氧化还原稳态方面，眼酸（ophthalmic acid）、γ-谷氨酰异亮氨酸、DL-焦谷氨酸等抗氧化周转相关代谢物积累，眼酸尤其指示谷胱甘肽耗竭。苯丙素和类黄酮途径中，(-)-表没食子儿茶素3-(4-甲基-没食子酸酯)、3',4',5,7-四羟基异黄酮、大豆苷元等酚类和类黄酮代谢物被专属检出。氨基酸和氮代谢方面，GABA、D-α-氨基丁酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸累积，尿囊素、尿囊酸等脲类化合物提示氮储存和再分配增加。核苷酸代谢和辅因子周转方面，1-甲基腺嘌呤、2'-脱氧腺苷、FAD和UDP-GlcNAc的检出提示核苷酸回收和氧化还原活性辅因子需求增强。膜重塑和碳水化合物代谢方面，PC(20:0/P-18:0)、植物鞘氨醇、3-O-β-D-半乳糖基-sn-甘油及D-木酮糖、麦芽三糖等参与渗透保护和碳再分配。

**金属及杂原子含生物分子的鉴定**：通过准确质量测定（<5 ppm质量误差）、同位素模式匹配、MS/MS碎裂分析以及ICP-MS/MS元素信号与HRMS分子离子的色谱共流出验证，推定注释了多种金属和杂原子含物种。组氨酸锰复合物的推定检出提示CuNP诱导的金属稳态破坏可能促进锰的胞内再分布。Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺及S、P等与氨基酸、有机酸、磷脂和糖肽类配体相关。以尿苷5'-二磷酸半乳糖（C₁₅H₂₄N₂O₁₇P₂）为例，通过-0.03 ppm准确质量、同位素分布和特征产物离子实现了含磷代谢物的确认。

**研究结论**

该研究表明，在线HILIC-ESI-HRMS-ICP-MS/MS平台是同时分子和元素表征转基因大豆愈伤组织的稳健且信息丰富的分析策略。在线联用实现了有机化合物与金属及杂原子含物种的色谱共检测，在单一工作流程中提供互补的代谢组学和形态学信息。递增CuNP浓度暴露产生更广泛多样的化学特征，尤其在最高剂量下，细胞防御、氧化应激和膜重塑相关代谢物显著富集。物种组学框架使得金属关联代谢物和杂原子含复合物的推定注释成为可能，揭示了必需元素再分布的证据，提示细胞水平的配位驱动稳态调整。生物学上，CuNP暴露诱导氧化应激并触发包括膜重塑、抗氧化防御途径激活以及氨基酸和氮代谢重编程在内的协调适应性响应。氧化脂类和脂质衍生代谢物的积累提示脂质过氧化增强和胁迫信号传导，而酚类和相关化合物丰度增加反映了保护性生化机制的激活以维持细胞氧化还原稳态。该研究推进了对纳米颗粒-植物相互作用的理解，展示了整合分子与元素耦合作为研究复杂生物系统强大平台的分析潜力，为未来精准农业背景下纳米颗粒诱导生化响应研究提供了有价值的框架。