豆瓣菜籽(Lepidium sativum L. seeds)中主要硫代葡萄糖苷——硫代苯甲酸葡萄糖苷(glucotropaeolin)对铜酮(cuprizone)诱导的小鼠多发性硬化模型的神经保护作用

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Neuroprotective effects of glucotropaeolin as the major glucosinolate of cress seed on cuprizone-induced mouse model of multiple sclerosis

　　

摘要：多发性硬化(Multiple Sclerosis, MS)是一种以炎症和髓鞘损伤为特征的神经退行性疾病。十字花科植物园圃豆瓣菜(Lepidium sativum L.，garden cress)种子(LSS)中含有的硫代葡萄糖苷(Glucosinolates, GLSs)具有抗炎特性。本研究评估了LSS中富含硫代葡萄糖苷组分(GF)和挥发性组分(VF)对MS小鼠模型(铜酮/cuprizone, CPZ诱导)的抗炎及神经保护作用。将C57BL/6雄性小鼠分为7组：正常组、CPZ组(饲料中添加0.4％ CPZ持续8周)、阳性对照(富马酸二甲酯/Dimethyl fumarate, DMF)组，以及分别经口给予LSS硫代葡萄糖苷组分(1、10 mg/kg)和皮下给予挥发性组分(1、10 mg/kg)每日1次持续21天的治疗组。进行行为学测试、组织病理学分析及基因表达分析。结果显示LSS硫代葡萄糖苷组分主要成分为glucotropaeolin，挥发性组分含苄基异硫氰酸酯(benzyl isothiocyanate, BITC)。行为学测试表明症状改善，组织病理学分析显示再髓鞘化增强，且髓鞘形成相关基因Olig2表达发生显著变化。LSS各组分通过促进再髓鞘化在MS中发挥神经保护作用，对核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)和核因子κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)通路影响较小。

论文解读：豆瓣菜籽硫代葡萄糖苷Glucotropaeolin对Cuprizone诱导小鼠多发性硬化模型的神经保护作用

多发性硬化(Multiple Sclerosis, MS)是中枢神经系统慢性进行性自身免疫性脱髓鞘疾病，病理特征为炎症、脱髓鞘、反应性胶质增生及神经轴突损伤，氧化应激和炎症是其重要病因。目前临床治疗药物存在副作用且无法完全阻止疾病进展，天然产物因其多靶点、低毒特性受到关注。园圃豆瓣菜(Lepidium sativum L.)种子含丰富硫代葡萄糖苷(Glucosinolates, GLSs)，其水解产物异硫氰酸酯(Isothiocyanates, ITCs)具有抗氧化、抗炎活性，其中glucotropaeolin是豆瓣菜籽主要GLSs之一，但其对MS的作用尚未见报道。研究人员采用经典铜酮(cuprizone, CPZ)诱导C57BL/6小鼠脱髓鞘模型，探讨豆瓣菜籽GLSs组分(含glucotropaeolin)及挥发性组分(含苄基异硫氰酸酯/benzyl isothiocyanate, BITC)对MS的神经保护及促再髓鞘化作用，并与阳性药富马酸二甲酯(Dimethyl fumarate, DMF)比较，以明确其疗效及可能机制。该论文发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》。

主要关键技术方法：

研究人员采集并鉴定L. sativum种子，用70%甲醇提取粗GLSs并经DEAE-Sephadex A-25柱硫酸酯酶解纯化得硫代葡萄糖苷组分(GF)，通过薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、核磁共振(¹H/¹³C-NMR)及质谱(MS)鉴定主要成分为glucotropaeolin；水蒸气蒸馏法提取挥发性组分(VF)，经气相色谱-质谱(GC-MS)分析确认含BITC。选用8周龄雄性C57BL/6小鼠，喂饲含0.4%(w/w) CPZ饲料8周建立MS模型，建模后随机分为7组(n=5)：正常组、CPZ模型组、DMF(100 mg/kg, 口服)阳性对照组、GF(1 mg/kg和10 mg/kg, 口服)组、VF(1 mg/kg和10 mg/kg, 皮下注射)组，给药21天。进行转棒试验(Rotarod test)、横梁行走试验(Beam walk test)、旷场试验(Open field test)评估运动功能；取脑行苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin, H&E)染色、Luxol Fast Blue(LFB)髓鞘染色及Nissl( cresyl violet)染色进行组织学评价；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测胼胝体区髓鞘形成相关基因Olig2、氧化应激相关Nrf2及炎症相关NF-κB的mRNA表达水平，以β-actin为内参。

研究结果

3.1. Identification of the major glucosinolate

HPLC显示GF在21 min出现单一对称主峰(占87.41%)，TLC及NMR、MS鉴定为desulfo-glucotropaeolin(硫代苯甲酸葡萄糖苷/苯甲基葡萄糖异硫氰酸酯前体)，确认GF主要活性成分为glucotropaeolin。

3.2. GC-MS analysis of the volatile fraction

VF中glucotropaeolin降解产物占总挥发性成分58.65%，主要为苄基腈(benzyl nitrile, 40.7%)和苄基异硫氰酸酯(BITC, 17.95%)，确认VF活性可能与BITC相关。

3.3. Acute toxicity

经急性毒性试验测定GF经口半数致死量(LD₅₀)为200 mg/kg，VF皮下注射LD₅₀为400 mg/kg，选用低于1/10 LD₅₀剂量(1、10 mg/kg)进行治疗实验，安全性良好。

3.4. Effect of glucosinolate & volatile fraction on behavioral test

Rotarod、Beam walk及Open field测试显示CPZ组运动协调、平衡及自主活动显著受损(p<0.001 vs 正常组)；GF(1、10 mg/kg 口服)及VF(10 mg/kg 皮下)组在第14、21天较CPZ组显著延长转棒停留时间、缩短横梁穿越时间、降低旷场不动时间(p<0.01或p<0.001)，改善程度与DMF相当，提示两组分可改善CPZ诱导的运动功能障碍。

3.5. Histopathological findings

3.5.1. Effect of LSS fractions on cuprizone-induced alterations in brain myelination status

H&E及Nissl染色示CPZ组海马区神经元皱缩退化、星形胶质细胞增多，GF 10 mg/kg组退化神经元最少；LFB染色示CPZ组胼胝体(CC)区髓鞘蓝染强度及面积显著降低，GF(10 mg/kg)及VF(10 mg/kg)组髓鞘负荷显著高于CPZ组(p<0.05或p<0.01)，接近DMF组水平，证实两组分促进再髓鞘化并具神经元保护倾向。

3.6. Gene expression studies

CPZ组Nrf2 mRNA显著下调、NF-κB mRNA显著上调(p<0.001 vs 正常组)，各治疗组与CPZ组相比Nrf2和NF-κB无显著差异；CPZ组少突胶质细胞转录因子Olig2 mRNA显著升高(OPCs代偿性激活)，GF(10 mg/kg)、VF(1、10 mg/kg)及DMF组Olig2表达较CPZ组显著下调(p<0.001)，提示治疗组减少了OPCs过度激活需求，可能通过保护成熟少突胶质细胞或促进髓鞘修复相关蛋白(MBP/PLP)表达发挥再髓鞘化作用，而非依赖Nrf2/NF-κB经典通路调控。

讨论与结论总结

讨论指出CPZ模型主要模拟原发脱髓鞘与再髓鞘过程，行为学与组织学在第14天差异最大说明干预加速早期修复。GF和VF通过glucotropaeolin及BITC发挥神经保护，Olig2下调反映成熟少突胶质细胞获保护、再髓鞘化进行，该作用不依赖Nrf2和NF-κB基因转录水平改变，可能涉及H₂S供体特性或抑制神经源性炎症等其他通路。作者认为作为可食用经济植物，豆瓣菜籽具成为MS辅助候选物的潜力，未来应补充MBP/PLP蛋白检测及炎症因子分析。

结论(翻译)：研究结果表明，豆瓣菜籽(LSS)的两组分均表现出神经保护作用并促进再髓鞘化(与CPZ组相比)。结果发现glucotropaeolin及其水解产物能够增强LFB染色强度及改善行为学测试从而诱导再髓鞘化。鉴于Nrf2和Nf-κB表达未见显著变化且治疗组Olig2表达下降，提示这些化合物通过替代途径发挥神经保护作用。考虑到该植物为可食用、易获取且经济可行的草本植物，所观察到的神经保护效应表明其在未来研究中可作为有前景的治疗候选物。