《Brain Research》：Tumor cell extracellular vesicles derived lncRNA XIST regulates the blood–brain barrier and NSCLC brain metastasis via miR-19b-3p/EPN2
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曹一强|柴文英|刘顺江|徐一多|唐当|邓兴利|罗一宇|蒋龙中国云南省昆明市650032，昆明医科大学第一附属医院神经外科摘要本研究旨在探讨源自肿瘤细胞外囊泡的非编码长RNA XIST在非小细胞肺癌脑转移中的作用及其分子机制。研究从患有脑转移的非小细胞肺癌患者及健康对照组中收集血清
曹一强|柴文英|刘顺江|徐一多|唐当|邓兴利|罗一宇|蒋龙
中国云南省昆明市650032，昆明医科大学第一附属医院神经外科
摘要
本研究旨在探讨源自肿瘤细胞外囊泡的非编码长RNA XIST在非小细胞肺癌脑转移中的作用及其分子机制。研究从患有脑转移的非小细胞肺癌患者及健康对照组中收集血清样本，检测XIST、miR-19b-3p和EPN2的mRNA表达水平。从A549细胞中分离出细胞外囊泡，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析及Western blot技术分析其形态与粒径特征。利用人脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞构建体外血脑屏障模型，经过24小时处理后，通过PKH67染色观察HBMECs和星形胶质细胞对细胞外囊泡的摄取情况。通过RT-qPCR、Western blot、跨内皮电阻测定、罗丹明-右旋糖酐渗透试验、免疫荧光染色、Transwell迁移试验以及交互式视频成像系统，评估XIST在维持血脑屏障完整性及非小细胞肺癌细胞侵袭中的作用。通过双荧光报告基因试验和RNA免疫沉淀技术确认XIST、miR-19b-3p和EPN2之间的相互作用。研究结果表明，A549细胞来源的细胞外囊泡具有典型特征，可被HBMECs高效摄取，从而导致跨内皮电阻值下降、紧密连接蛋白表达减少以及罗丹明-右旋糖酐渗透性增加。在患有脑转移的非小细胞肺癌患者以及A549和H1299细胞中，XIST表达过度，而在A549细胞中敲低XIST可改善血脑屏障功能并抑制该细胞及H1299细胞的侵袭能力。在HBMECs中敲低EPN2产生的效应与敲低XIST类似。值得注意的是，敲低miR-19b-3p可部分逆转EPN2敲低对血脑屏障完整性及非小细胞肺癌细胞侵袭的影响。体内实验表明，抑制XIST可通过改善血脑屏障功能减轻非小细胞肺癌的脑转移。从机制上来看，XIST通过结合miR-19b-3p来上调EPN2的表达。综上所述，在A549细胞中抑制XIST可通过调控miR-19b-3p/EPN2轴来减轻血脑屏障损伤并抑制非小细胞肺癌的脑转移。
引言
肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占所有肺癌患者的90%（De Groot等人，2018年）。大脑是非小细胞肺癌患者常见的转移部位，超过50%的晚期非小细胞肺癌患者会出现脑转移，这类转移往往伴随神经损伤，导致预后不良（Skakodub等人，2023年）。针对患有脑转移的非小细胞肺癌患者，治疗方法包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗以及联合治疗。与传统放疗相比，全脑放疗能提高患者的总生存期和无进展生存期；但有些研究表明，全脑化疗的不良反应发生率为50%–75%，甚至还会导致患者出现认知功能下降（Lee和Ahn，2021年）。血脑屏障是控制分子进入中枢神经系统的重要屏障，同时也是药物进入中枢神经系统的巨大障碍。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞以及内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞构成的紧密连接复合体组成。脑微血管内皮细胞通过与紧密连接蛋白结合，构成血脑屏障的结构基础。在脑转移过程中，血脑屏障会遭到破坏，血肿瘤屏障的通透性也会增加（Terceiro等人，2023年），但这一过程的调控机制目前尚不清楚。
细胞外囊泡携带大量RNA、核酸、跨膜蛋白、脂质及其他物质（Isaac等人，2021年）。细胞外囊泡从细胞表面释放后会与受体细胞的质膜融合，将其所含物质送入受体细胞并影响其功能（Zhang等人，2020年）。例如，三阴性乳腺癌来源的细胞外囊泡中所含的长非编码RNA MALAT1可促进巨噬细胞的M2极化，进而推动三阴性乳腺癌的发生与发展（Wang等人，2024年）。
许多长非编码RNA参与调控肺癌细胞的增殖、转移等生物学过程（Yang等人，2023年）。长非编码RNA还可以作为ceRNA，通过结合miRNA来调控mRNA的表达。长非编码RNA AIFM2-1可通过结合miR-330-3p来促进CD244的表达，进而帮助乙型肝炎病毒感染的肝细胞癌实现免疫逃逸（Xie等人，2023年）。m5C甲基化的长非编码RNA NR_033928可通过稳定GLS mRNA来促进胃癌细胞的增殖并改变其谷氨酰胺代谢模式（Fang等人，2023年）。长非编码RNA X-inactive specific transcript（XIST）可调控细胞增殖、凋亡、炎症反应以及自噬等多种生理过程。一些研究表明，XIST会促进结直肠癌（Yang等人，2020年）、卵巢癌（Jiang等人，2021年）、肝癌（Yang等人，2021年）以及乳腺癌（Ma等人，2023年）的发生与发展。Jiang等人（2020年）发现，无论是在体内还是体外环境中，非小细胞肺癌中的XIST表达均处于上调状态。敲低XIST可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，增加其凋亡率，并限制其在体内的生长。不过，XIST是否参与血脑屏障的调控以及是否在非小细胞肺癌的脑转移过程中起作用，目前仍不明确。
本研究旨在探讨XIST在血脑屏障功能及非小细胞肺癌脑转移中的作用机制。研究结果表明，在A549细胞中抑制XIST可结合miR-19b-3p并抑制epsin 2（EPN2）的表达，从而改善血脑屏障功能，抑制非小细胞肺癌的脑转移，这一效应在体外及体内实验中均得到验证。
章节要点
样本收集
2024年6月至2026年5月期间，我们从医院体检中心收集了30例伴有脑转移的非小细胞肺癌患者以及30名健康人的血清样本。纳入标准如下：充分了解研究内容并自愿参与，且已签署知情同意书；在我院被确诊为患有脑转移的非小细胞肺癌；年龄在18至80岁之间。患有神经系统疾病或血液系统疾病的
A549细胞来源的细胞外囊泡可调节体外血脑屏障功能
为探究A549细胞来源的细胞外囊泡在血脑屏障功能中的作用，我们从A549细胞中分离出细胞外囊泡，通过透射电子显微镜观察到这些囊泡具有典型的杯状形态和双层膜结构（图1A）。纳米颗粒追踪分析显示，这些细胞外囊泡的直径在90–200纳米之间（图1B）。与A549细胞上清液相比，这些细胞外囊泡中Alix、CD9、CD63和TSG101等标志物表达水平更高（图1C）。随后，我们利用HBMECs和星形胶质细胞构建了体外血脑屏障模型，再使用A549细胞来源的
讨论
细胞外囊泡携带多种生物分子，可在抗原表达、免疫调节、药物耐药性、细胞迁移以及细胞凋亡等方面发挥作用，同时也是细胞间信息传递的新载体。在本研究中，我们在体外利用HBMECs和星形胶质细胞构建的血脑屏障模型中发现，HBMECs会吞噬从A549细胞中分离出的细胞外囊泡。吞噬细胞外囊泡后，HBMECs的通透性会增加，其紧密连接蛋白也会遭到破坏。在非小细胞肺癌细胞的细胞外囊泡以及相应患者的血清中，XIST表达水平均处于上调状态
研究的局限性
目前的研究数据仅表明A549细胞来源的细胞外囊泡处理与HBMECs中XIST表达水平的变化之间存在关联，其背后具体的调控机制仍有待进一步阐明。此外，本研究中所使用的细胞外囊泡的纯度还需要更严格的检测。同时，也并未开展针对XIST的经典 rescue实验。值得注意的是，可能存在涉及EPN2的下游调控机制，其他长非编码RNA的异常表达也可能对研究结果产生影响
CRediT作者贡献说明
曹一强：文章撰写——审阅与编辑，文章撰写——初稿撰写，概念设计。柴文英：文章撰写——审阅与编辑，验证，方法学，概念设计。刘顺江：文章撰写——审阅与编辑，验证，方法学。徐一多：文章撰写——审阅与编辑，验证，方法学。唐当：文章撰写——审阅与编辑，验证，方法学。邓兴利：文章撰写——审阅与编辑，可视化，软件应用。罗一宇：文章撰写——审阅与编辑，可视化，软件应用。
伦理审批
动物实验已获得云南Labreal生物技术有限公司实验动物伦理委员会的批准（批准号PZ20230108）。
资金支持
本研究得到了云南省科学技术厅与昆明医科大学联合开展的专项重点项目（项目编号202101AY070001-015）的支持。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
