一种微流控人类血脑屏障模型揭示了电子烟添加剂引发的神经血管毒性及屏障功能破坏

《Chemico-Biological Interactions》：A Microfluidic Human Blood–Brain Barrier Model Reveals Neurovascular Toxicity and Barrier Disruption Induced by E-Cigarette Additives

　　

尹长风|李晓|于飞举|王旭然|田玉山|王红娟|陈一博|韩顺雷|陈欢|侯宏伟

中国国家烟草质量监督检验中心，烟草生物效应重点实验室，中国郑州450001

摘要

电子烟的日益普及引发了对其神经毒性可能性的担忧。调味剂的使用可能会损害血脑屏障；然而，由于缺乏生理相关的体外模型，其作用机制至今仍不甚明了。在此，我们构建了一种动态微流控血脑屏障共培养模型（CPAC-Co），该模型在生理剪切应力作用下整合了人脑内皮细胞和星形胶质细胞。与传统模型相比，CPAC-Co模型在屏障完整性、外排活性以及药物渗透性预测方面表现更优。利用这一经过验证的平台，我们检测了七种常用的电子烟添加剂（乙醇、薄荷醇、WS-23、乳酸、苯甲酸、乙基麦芽酚和甲基环戊烯酮）。乙醇、乙基麦芽酚和甲基环戊烯酮显著增加了尼古丁的渗透性，并降低了跨上皮电阻，表明血脑屏障功能受损。这些变化伴随着内皮细胞凋亡、紧密连接基因表达下调以及氧化/亚硝化应激和炎症反应的激活。转录组分析进一步显示，与炎症和应激相关的通路如NF-κB和NOD样受体信号通路出现上调。我们的研究不仅确立了CPAC-Co作为一种用于神经血管毒性筛选的强大且具有生理相关性的模型，还为评估电子烟添加剂的安全性提供了实验依据，强调了在监管政策中需考虑这些添加剂对中枢神经系统的潜在风险。

引言

全球范围内电子烟使用的迅速普及，尤其是在青少年中的流行，使其化学添加剂成为一种新的、广泛存在的人类吸入暴露源，这无疑是一个重大的环境健康问题[1]。电子烟液由丙二醇、甘油、尼古丁以及各种调味剂组成，会被刻意雾化以便直接吸入，从而导致大规模的人群暴露[2]、[3]。由于电子烟被宣传为比传统烟草更安全的替代品，其使用速度进一步加快，这就迫切需要全面评估其系统性毒性，尤其是对那些脆弱的生物屏障的影响。其中，血脑屏障作为中枢神经系统的主要保护结构，起着至关重要的作用。这一高度动态的屏障由脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞及周细胞共同构成，通过选择性控制物质进入大脑来维持脑部稳态[4]。它的功能依赖于物理上的紧密连接、主动的外排转运蛋白以及代谢酶的共同作用[5]、[6]。血脑屏障功能的破坏已被认为是多种神经系统疾病的诱因，因此它是评估神经毒性的关键指标。

越来越多的证据表明，接触电子烟气溶胶会对血脑屏障造成不良影响。有研究指出，暴露于电子烟气溶胶后，血脑屏障的完整性会下降，紧密连接蛋白的表达会减少，神经炎症会被诱发，而像GLUT1这样的关键营养物质转运蛋白的功能也会发生改变[7]、[8]、[9]。值得注意的是，最新研究显示，许多这些不良效应可能是由非尼古丁成分，尤其是各种调味化学物质所引起的。这些成分能够引发氧化应激和炎症反应，而这些正是导致血脑屏障功能障碍的关键途径[10]。不过，目前大多数关于其作用机制的研究都是基于静态的体外单细胞培养或动物模型，这类模型无法充分模拟体内血脑屏障微环境中的动态血流状况及多细胞间的相互作用[11]。因此，对于种类繁多且不断变化的电子烟添加剂，目前还缺乏系统且具有生理背景的安全性评估，这也阻碍了可靠的风险评估工作的开展。

为弥补这一不足，亟需开发出能更好模拟人体生理状态的先进体外模型。器官芯片技术，尤其是微流控血脑屏障模型，已成为环境毒理学领域的一项突破性技术。通过结合微制造技术和组织工程学，这类平台能够精确控制流体流动，从而产生生理性的剪切应力，并在受控的微环境中实现相关细胞类型的三维共培养[12]。这一核心优势使得所构建的人体屏障模型在表型成熟度、功能性以及化合物渗透性和毒理反应预测准确性方面均优于静态系统[13]、[14]。因此，这类模型为研究在接近生理条件的情况下吸入性有毒物质如何影响神经血管单元提供了有力的工具。

在本研究中，我们构建了一种微流控血脑屏障共培养模型（CPAC-Co），该模型在生理剪切应力作用下整合了人脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞。利用这一仿生平台，我们系统地检测了七种常见的电子烟添加剂，包括各种有机酸类冷却剂、风味增强剂以及乙醇等，旨在评估它们对血脑屏障功能的影响并揭示其背后的作用机制。我们的研究证明了CPAC-Co是一种有效的筛选工具，同时也为某些吸入型电子烟添加剂如何破坏血脑屏障提供了重要证据。这些发现为制定针对有害化学物质吸入暴露的特殊安全标准提供了有力支持。

章节节选

材料

人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）和星形胶质细胞（SVG P12）细胞系购自北京普赛尔生命科技有限公司。商业用的恒定流速灌注阵列芯片（CPAC）则来自北京大象生物科技有限公司。Transwell培养板则由康宁公司提供。

本研究使用了以下化学试剂：罗丹明123（Rh123）、3,3′-二乙氧基羰基氰化碘（DiOC₂(3)）、Ko-143、MK-571、吉非替尼和奥西替尼（均来自MCE公司）；荧光素钠（FITC-Na）以及

血脑屏障模型的构建与表征

本研究构建了三种体外血脑屏障模型并进行了系统评估（见图S1A–D）：静态单细胞培养模型（Transwell-Mono）、微流控单细胞培养模型（CPAC-Mono）以及微流控内皮细胞-星形胶质细胞共培养模型（CPAC-Co）。在生理相关的剪切应力作用下，CPAC-Co模型表现出最高的屏障完整性，其峰值TEER值为251.9 Ω·cm²，远高于CPAC-Mono模型（220.8 Ω·cm²）和Transwell-Mono模型（98.4 Ω·cm²）（见图1A）。这种优异的性能提升

讨论

器官芯片技术的快速发展使得人们能够构建出更能模拟关键生理特征的体外血脑屏障模型，比如流体剪切应力以及多细胞间的相互作用[21]。在本研究中，我们成功构建并验证了一种新型的微流控共培养模型（CPAC-Co），该模型在生理剪切应力作用下将人脑内皮细胞与星形胶质细胞相结合。CPAC-Co模型出色的屏障完整性体现了流体剪切应力与其它因素之间的协同作用

结论

综上所述，本研究通过采用先进的微流控血脑屏障模型，证明了常见的电子烟添加剂可通过相互关联的炎症反应和细胞应激途径直接破坏血脑屏障功能。这些发现引发了关于反复吸入化学添加剂的安全性的重大环境健康担忧，同时也为这些添加剂可能有助于神经毒性物质进入中枢神经系统提供了机制上的解释。我们的研究进一步强调了

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

CRediT作者贡献说明

于飞举：写作——审阅与编辑，研究，正式分析。李晓：写作——审阅与编辑，写作——初稿，研究，正式分析，概念设计。尹长风：写作——审阅与编辑，写作——初稿，可视化，研究，正式分析。陈一博：写作——审阅与编辑，可视化，正式分析。王红娟：写作——审阅与编辑，验证。田玉山：写作——审阅与编辑，方法学。王旭然：

数据可用性

RNA测序数据已存储在NCBI SRA数据库中，编号为PRJNA1375499。其他数据将根据请求提供。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了以下机构的支持：中国国家自然科学基金（项目编号52503207）、中国博士后科学基金会（项目编号2024M763656）、北京生命科学研究院的科技项目（项目编号2024100CC0110、2024501QPIC05以及2024102QPID06），还有中国国家烟草质量监督检验中心提供的资助（项目编号552024CR0010和110202403001）。