创新性黏膜纳米载体系统用于增强针对呼吸道病原体的免疫应答

《Journal of Advanced Research》：Innovative mucosal nanocarrier systems for enhanced immune response against respiratory pathogens

　　

有效肺部疫苗接种仍受限于肺表面活性物质（PS）屏障以及疫苗货物向肺泡抗原呈递细胞（尤其是肺泡巨噬细胞）的低效胞内递送。受肺泡巨噬细胞来源囊泡与肺泡环境天然相容性的启发，研究人员开发了仿生肺泡巨噬细胞膜囊泡（AMVs）作为黏膜纳米载体平台。本研究旨在开发一种应对肺部关键细胞外和细胞内屏障的纳米疫苗平台，并在多种呼吸道病原体模型中评估其免疫原性和保护效力。AMVs经过工程化改造，以改善其在PS环境中的性能并实现对肺泡巨噬细胞的优先摄取。研究人员整合了抗原捕获与胞质递送系统（ACCDS），该系统包含：（1）用于广泛病原体结合的工程化表面活性蛋白A结构域；（2）设计用于促进内体/溶酶体逃逸并增强货物胞质可及性的pH响应性李斯特菌溶素O模块；（3）封装的Poly(I:C)以激活TLR3并支持RIG-I/MDA5相关信号。与合成纳米颗粒和商业转染试剂相比，AMV-ACCDS-Poly(I:C)在PS相关环境中显示出改善的递送性能，并优先被肺泡巨噬细胞摄取。双先天激活与比测试对照配方诱导更强的IFN-β和IL-18反应相关。该平台促进了肺驻留记忆样CD8⁺T细胞的局部建立和/或分化，并伴随IL-18相关的代谢重塑。在初免-加强研究中，它在致死性流感病毒和伪狂犬病毒攻毒模型中提供了完全保护，并降低了支原体感染模型中的肺部载量。AMV-ACCDS-Poly(I:C)提供了一种仿生策略以应对肺部疫苗接种的关键障碍，并支持基于膜的黏膜疫苗系统用于保护对抗呼吸道病原体的潜力。

**论文解读：仿生肺泡巨噬细胞膜纳米载体系统用于增强呼吸道黏膜免疫**

**研究背景、问题与目的**
呼吸道病原体（如SARS-CoV-2、流感病毒、肺炎链球菌和肺炎支原体）对全球公共卫生构成持续严重威胁。传统肌肉注射疫苗虽能引发全身免疫，但往往无法在病原体主要入侵部位——呼吸道黏膜提供充分保护，主要原因是其难以有效克服肺部的独特生物学屏障并诱导持久的组织驻留记忆反应。其中，两个关键障碍是免疫抑制性肺表面活性物质（PS）屏障和疫苗抗原向肺泡抗原呈递细胞（APCs），尤其是肺泡巨噬细胞（AMs）的低效胞质递送。有效诱导肺驻留记忆CD8⁺T（TRM）细胞是黏膜免疫的核心，但其面临严重挑战。受肺泡巨噬细胞来源囊泡与肺泡环境天然相容性的启发，研究人员旨在开发一种仿生黏膜纳米载体平台，通过工程化改性克服上述双重障碍，增强局部免疫应答并提供广谱保护。

**研究内容与结论**
研究人员开发了仿生肺泡巨噬细胞膜囊泡（AMVs）作为纳米载体，并整合了抗原捕获与胞质递送系统（ACCDS）及Poly(I:C)佐剂，形成AMV-ACCDS-Poly(I:C)平台。该平台在PS环境中展现了优越的递送性能，优先被肺泡巨噬细胞摄取，并通过TLR3与RIG-I/MDA5双通路激活先天免疫，诱导可控的IFN-β和IL-18反应，进而促进CD8⁺TRM样细胞的分化与代谢重编程。在致死性流感病毒和伪狂犬病毒攻毒模型中实现了完全保护，在支原体感染模型中大幅降低肺部载量。研究表明，该平台为克服肺部疫苗接种的关键障碍提供了仿生策略，支持基于膜的黏膜疫苗系统用于保护呼吸道病原体的潜力。该论文发表在《Journal of Advanced Research》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用了以下关键技术方法：基于肺泡巨噬细胞膜制备仿生囊泡（AMVs），并利用电穿孔法封装Poly(I:C)；通过基因工程构建ACCDS模块，包括具有广谱病原体结合能力的截短型SP-A-CRD结构域和pH响应性李斯特菌溶素O（LLO）；使用动态光散射、Zeta电位和透射电镜进行纳米囊泡表征；通过溶血试验评估LLO的pH依赖性膜破坏活性；利用AlphaFold3分子对接预测SP-CRD与病原体黏附素的相互作用，并以ELISA和流式细胞术验证抗原捕获效率；采用共聚焦显微镜分析细胞内抗体逃逸；通过RNA-seq和Seahorse代谢分析评估免疫激活和T细胞代谢；采用肺泡巨噬细胞耗竭（氯膦酸脂质体）和基因敲低（LNP递送shRNA）进行机制验证；使用BALB/c和OT-I小鼠模型进行体内免疫和攻毒实验（小鼠来源：扬州大学比较医学中心、南京必凯生物技术有限公司）。
**研究结果**
**Biomimetic alveolar macrophage vesicles (AMVs) overcome pulmonary surfactant barriers**
通过比较AMVs、天然肺泡巨噬细胞来源外泌体（AEs）、DPPC脂质纳米颗粒（LNPs）和商业转染试剂Invivofectamine，研究发现AMVs和AEs均能有效抵抗PS介导的摄取抑制，而DPPC LNPs的摄取减少超过60%。体内给药后，AMVs递送的Poly(I:C)对肺泡巨噬细胞的靶向效率比DPPC LNPs高3.2倍，比Invivofectamine高约5.1倍。此外，AMVs的产量比天然外泌体高21倍，且具有良好的物理化学稳定性。

**Engineering pathogen capture and cytosolic delivery modules on AMVs**
通过在AMVs表面表达SP-A-CRD和LLO，AMV-ACCDS保留了均匀的球形形态和理化特性。AlphaFold3预测显示SPC-TRIMER能与支原体P97R1黏附素、流感HA和肺炎支原体CARDS毒素形成相互作用。ELISA和流式细胞术证实AMV-ACCDS具有显著增强的抗原捕获能力和PS穿透能力。共聚焦显微镜显示，携带LLO的AMV-ACCDS在16小时内显著减少与溶酶体的共定位，证实其介导的内体/溶酶体逃逸功能，并能促进抗原货物进入胞质。

**Spatiotemporally controlled innate immune activation by AMV-ACCDS-Poly(I:C)**
AMV-ACCDS-Poly(I:C)在12小时内迅速诱导肺泡巨噬细胞表达CD40和CD80共刺激分子，且表达持续至36小时。qPCR检测到急性转录上调（Ifnb1、Cxcl10、Gmcsf、Ccl2/3/5），但至36小时恢复正常，且无明显IL-10升高。BALF中IFN-β呈一过性升高，TNF-α蛋白未显著改变。与游离CpG或MPL-A混合物相比，只有完整平台能引发IFN-β反应。组织学分析显示，给药后无中性粒细胞浸润、上皮损伤或胶原沉积，证实其良好的生物相容性。

**Alveolar macrophage-dependent induction of antigen-specific CD8+ TRM-like cells**
以支原体模拟卵清蛋白囊泡（MCO）为模型抗原，MCO-AMV-ACCDS-Poly(I:C)免疫小鼠后，肺内OVA特异性（SIINFEKL⁺CD44⁺）CD8⁺T细胞数量增加3倍。这些细胞表现出增强的线粒体适应性（基础耗氧率升高、OCR/ECAR比值增加、ATP产量升高、mtDNA/nDNA比值升高）以及OXPHOS相关基因上调。该过程依赖于肺泡巨噬细胞，氯膦酸脂质体耗竭AM后，TRM样细胞扩增消失。体外共培养实验证实，载有MCO-AMV-ACCDS-Poly(I:C)的AMs能促进OT-I CD8⁺T细胞增殖和IFN-γ产生，且该效应受Brefeldin A抑制。

**Compartment-bridging innate signaling drives TRM differentiation**
RNA-seq分析显示，AMV-ACCDS-Poly(I:C)免疫小鼠的肺泡巨噬细胞中有1874个差异表达基因，上调基因富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号和NOD样受体信号等通路。GSEA证实抗原呈递和I型干扰素通路激活。通过Csf1r启动子驱动的shRNA特异性敲低肺泡巨噬细胞中的TLR3、RIG-I和MDA5后，IFN-α/β和IL-18分泌显著减少，干扰素刺激基因表达降低，且肺内CD8⁺TRM样细胞比例和激活状态均下降。MCO-AMV-ACCDS-Poly(I:C)免疫组BALF和AM裂解液中IL-18水平升高约3倍，而IL-15无显著变化。体外加入IL-18中和抗体后，CD4⁺T细胞产生的IFN-γ被明显抑制，表明IL-18是驱动TRM分化的关键因子。

**Broad-spectrum bacterial protection via coordinated mucosal-systemic immunity**
针对猪肺炎支原体和肺炎支原体模型的疫苗实验显示，AMV-ACCDS-Poly(I:C)显著增强了血清中抗原特异性IgG、IgG1、IgG2a以及呼吸道黏膜分泌型IgA（sIgA）水平。同时，它诱导了最明显的肺驻留抗原特异性CD8⁺TRM样细胞扩增（比单独疫苗高2.1倍），并增加了脾细胞中IFN-γ⁺CD8⁺T细胞比例。攻毒后，该组小鼠肺部细菌载量最低，组织病理学炎症最轻微。

**Potent antiviral efficacy against phylogenetically distinct respiratory viruses**
针对伪狂犬病毒（PRV，DNA病毒）和甲型流感病毒（H1N1，RNA病毒）的疫苗实验中，AMV-ACCDS-Poly(I:C)同样显著提高了病毒特异性sIgA和血清IgG水平，并特异性扩增了肺内CD8⁺TRM样细胞（CD44⁺CD69⁺CD103⁺），同时诱导了最高的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞频率。在致死性PRV攻毒中，该平台实现100%存活率，流感攻毒中同样100%存活，而游离Poly(I:C)组仅40%存活。CD8α⁺T细胞耗竭后，保护作用显著下降（存活率降至50%），证明CD8⁺TRM细胞在抗病毒免疫中起关键作用。

**总结讨论与结论**
研究讨论部分指出，本研究存在若干局限性：仅使用BALB/c小鼠，尚未在更多品系中验证；未完全区分原位分化与招募后的组织驻留；LLO介导的细胞内逃逸机制尚需直接可视化的证据；pH依赖性溶血试验不能直接代表肺泡上皮安全性；未直接探究制剂如何穿越鼻黏膜上皮屏障；未与临床建立的黏膜疫苗平台进行广泛比较；重复给药可能引发抗载体免疫等。但这些局限性不影响主要发现。结论部分翻译如下：尽管存在这些局限性，本研究确立了AMV-ACCDS-Poly(I:C)作为一种多功能的黏膜疫苗平台，结合了仿生囊泡工程与可控的胞内佐剂递送。AM来源的囊泡促进穿过黏膜屏障的运输，而工程化的抗原捕获结构域可实现模块化和适应性抗原装载。pH响应性LLO的引入提供了支持性功能证据，表明其增强了抗原和Poly(I:C)的胞内共递送，这与RIG-I、MDA5和TLR3相关先天免疫通路的协同激活有关。这些反应进一步与IFN-β/IL-18相关的程序化、CD8⁺组织驻留记忆样T细胞分化以及符合肺组织驻留的代谢重塑相关联。在测试的攻毒模型中，AMV-ACCDS-Poly(I:C)对致死性呼吸道病毒提供了完全保护，并将细菌载量降低超过3个数量级，这种保护主要依赖于CD8⁺组织驻留记忆反应。这些发现为开发针对多种呼吸道病原体的可吸入疫苗策略提供了强有力的理论基础。