阴阳因子1特异性支持Olig2阳性小脑星形胶质细胞的发育

《GLIA》：Yin Yang 1 Specifically Supports the Development of Olig2 Positive Cerebellar Astrocytes

　　

研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据鉴定并表征了小脑中表达转录因子Olig2（O2AST）的星形胶质细胞亚群，定义了其分子身份以及与其它已确立的小脑星形胶质细胞亚群和同样表达Olig2的少突胶质细胞谱系细胞的转录差异。体内特异性敲除星形胶质细胞中的Olig2影响小鼠的运动能力。研究人员发现，小脑O2AST在小脑核（cerebellar nuclei，CN）中相对丰富，但在小脑叶中则不然。小脑O2AST高表达一组独特基因，包括Slc6a11、Gpc5、Igsf1、Alpl和Egfl6。此外，研究人员检查了已知控制小脑星形胶质细胞成熟的转录因子阴阳因子1（Yin Yang 1，YY1）对O2AST分化和形态的调控影响。从星形胶质细胞中特异性敲除Yy1增加了小脑核中O2AST的数量，影响了O2AST的分化以及其与少突胶质细胞谱系细胞的交叉通讯，减少了少突胶质前体细胞（OPC）向成熟少突胶质细胞的分化。总之，这些发现揭示了小脑中一个独特的、转录组上特异的表达Olig2的星形胶质细胞亚群，揭示了Yy1在出生后发育过程中协调的新型调控机制。

**小脑Olig2阳性星形胶质细胞的发育与YY1调控：单细胞转录组与功能研究解读**

**研究背景**

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中数量最丰富的胶质细胞，在突触稳态、代谢支持、离子平衡及血脑屏障维持中发挥关键调控作用。传统观点认为星形胶质细胞为均质群体，但单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步揭示了其在CNS不同区域、发育阶段及神经退行性疾病进展中的高度分子和功能异质性。这些异质性亚群由内在模式化程序以及与神经元的区域特异性通讯共同产生。转录因子Olig2传统上被视为少突胶质细胞谱系（包括少突胶质前体细胞（OPC）和成熟少突胶质细胞（OL））的标志物，但近年研究发现其在发育期及损伤后的星形胶质细胞中也有表达，挑战了经典的胶质细胞身份认知。已有研究在嗅球、皮层、中脑、丘脑、延髓、小脑和脊髓中鉴定出表达Olig2的星形胶质细胞亚群（O2AST），在正常生理条件下约占所有星形胶质细胞的4.3%，且具有独特转录谱。小脑是运动协调和认知过程的关键脑区，其出生后发育显著，为研究星形胶质细胞亚群的生成和成熟动态提供了独特模型。小脑主要星形胶质细胞亚群包括支持浦肯野神经元的Bergmann胶质细胞（BG）、支持颗粒神经元的velate星形胶质细胞（VA）以及位于白质中的纤维状星形胶质细胞（FA）。尽管小脑O2AST的存在已有报道，但其具体定位、形态、功能及特异性标志物尚未明确。转录因子阴阳因子1（YY1）是一种普遍表达的架构转录因子，可创建染色质活性环，调控神经上皮发育、神经祖细胞增殖与存活，并在星形胶质细胞中高表达，对星形胶质细胞成熟至关重要。YY1缺失可导致小脑神经退行性变，但其在小脑O2AST中的具体作用尚不清楚。因此，本研究旨在系统鉴定小脑O2AST的分子特征、空间分布，并探究YY1对其分化和功能的调控机制。

**主要研究方法**

研究人员主要采用以下关键技术方法：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析：对P10和P17小鼠小脑（野生型与Yy1条件性敲除）的公共数据集（GSE166792）进行重新聚类、差异基因表达分析和基因本体（GO）富集分析，鉴定O2AST及其分子特征；2）免疫荧光染色与共聚焦显微成像：利用Yy1^loxP/loxP；Aldh1L1-EGFP与Yy1^ΔAST；Aldh1L1-EGFP小鼠（6-7周龄、P10、P17及6-7月龄），结合多种抗体对Olig2、GFAP、ALDH1L1等蛋白进行定位与定量分析，并运用IMARIS进行三维形态学重建与Sholl分析；3）AAV介导的基因编辑（GEARBOCS系统）：设计靶向Olig2的gRNA，构建GEARBOCS载体并包装为AAV-PHP.eB血清型，通过眶后注射注入Rosa26-floxed STOP-Cas9-EGFP敲入小鼠，实现星形胶质细胞特异性Olig2敲除；4）行为学测试：采用平衡木实验评估小鼠的运动协调能力；5）实时定量PCR（qPCR）：检测小脑核中特定基因（如O2AST标志物、胆固醇合成相关基因、炎症因子等）的mRNA表达水平。

**研究结果**

**3.1 小脑中表达Olig2的星形胶质细胞的鉴定**：通过重新分析scRNA-seq数据，研究人员发现小脑中存在一群表达Olig2的星形胶质细胞（O2AST），其转录组特征明显区别于OPC、OL以及不表达Olig2的星形胶质细胞（nO2AST）。差异基因表达分析鉴定出9个在O2AST中特异性上调的基因（Foxb1、Slc6a11、Sall3、Hey1、Alpl、Gpc5、Igsf1、Egfl6、Igfbp2）和3个特异性下调基因（Hopx、Vim、Thyn1），这些基因在OPC和OL中几乎不表达，表明O2AST具有独特的分子标签。

**3.2 YY1支持O2AST分化/成熟**：比较P10和P17的转录组发现，O2AST在出生后分化过程中转录变化不如nO2AST显著。在P17，Yy1缺失导致O2AST出现大量基因表达改变（如Tenm4、Cd38、Clu、Aqp4等显著下调），表明Yy1对O2AST转录身份建立和维持至关重要。GO分析显示，与BG相比，O2AST可能参与脂质分解和GABA能突触传递等独特功能。

**3.3 O2AST在小脑中的空间定位**：免疫荧光定量分析表明，O2AST（Olig2⁺EGFP⁺细胞）主要定位于小脑核（CN），在颗粒细胞层、白质和分子层中极少。Yy1缺失后，CN中O2AST数量显著增加，其复杂度升高、GFAP表达上调，而O2AST标志物（Alpl、Slc6a11、Igsf1）表达降低。

**3.4 Yy1对O2AST和nO2AST形态的差异发育效应**：P10时，Yy1缺失对O2AST和nO2AST均无明显影响。P17时，Yy1缺失导致CN和分子层中O2AST数量增加，但形态无显著改变；而nO2AST已出现显著形态变化。至6-7周龄，Yy1缺陷型O2AST出现明显的时程依赖性形态改变，且持续至至少7月龄。利用GEARBOCS工具特异性敲除星形胶质细胞中的Olig2显著降低CN中Olig2表达，并导致小鼠平衡木通过时间延长，证明O2AST具有生理功能。

**3.5 含Yy1缺陷星形胶质细胞的小脑核发生神经炎症**：在P17和成年动物CN中，Yy1缺失导致IBA1⁺小胶质细胞数量增加、形态改变，并上调促炎因子（IL-1β、iNOS、CCL5、CXCL10）的mRNA水平。尽管O2AST中Aqp4表达下调，但CN中整体AQP4蛋白水平未变，可能是由于占多数的nO2AST未受影响。

**3.6 YY1调控的星形胶质细胞-少突胶质细胞相互作用对少突胶质细胞分化至关重要**：Yy1缺失在CN中引起OPC（Olig2⁺EGFP^-细胞）数量显著增加，但成熟OL（MBP⁺、CC1⁺）数量无显著变化。scRNA-seq分析显示，Yy1缺失的星形胶质细胞中Nfe2l2（编码Nrf2）表达上调，同时胆固醇合成关键酶（Dhcr7、Dhcr24）表达降低，而Nrf2激活已知会抑制OPC分化。此外，缝隙连接蛋白Gja1（编码Cx43）和Gjb6（编码Cx30）在Yy1缺陷的星形胶质细胞中表达降低，可能破坏星形胶质细胞-少突胶质细胞间的通讯，导致OPC分化受阻。

**结论与讨论**

本研究鉴定出小脑核中一群表达Olig2的星形胶质细胞亚群（O2AST），其具有独特的转录组特征（高表达Slc6a11、Gpc5、Igsf1、Alpl等），可能参与GABA能神经传递、突触重塑和神经发育。特异性敲除星形胶质细胞中的Olig2损害小鼠运动功能，证实了O2AST的生理学重要性。转录因子YY1是O2AST数量的关键调控因子，并控制其正常分化；星形胶质细胞中Yy1缺失通过上调Nrf2通路、下调胆固醇合成和缝隙连接蛋白表达，破坏了星形胶质细胞与OPC之间的交叉通讯，导致OPC分化受阻，并引发小脑核的神经炎症。这些发现不仅增进了对小脑星形胶质细胞异质性的理解，也为星形胶质细胞与少突胶质细胞谱系细胞间的相互作用提供了新机制，提示Yy1在维持胶质细胞稳态和正常髓鞘形成中的核心角色。该研究发表在《GLIA》。