硫化氢（H2S）挽救HIV Tat驱动的小胶质细胞铁死亡：对HIV相关神经炎症的启示

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Hydrogen Sulfide Rescues Microglia From HIV Tat-Driven Ferroptosis: Implications for HIV-Associated Neuroinflammation

　　

目的：HIV反式激活因子转录蛋白（Tat）在NeuroHIV中可诱导氧化应激、神经炎症及胶质细胞功能障碍。铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的调控性细胞死亡形式，已被证实参与HIV相关神经认知障碍的病理过程。本研究旨在探讨硫化氢（H₂S）能否减轻小胶质细胞中HIV Tat诱导的铁死亡。
方法：研究人员采用硫化氢供体硫氢化钠（NaHS；100 μM）预处理BV2小胶质细胞，随后给予重组HIV Tat（100 ng/mL，48 h）刺激。通过荧光检测法及乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估铁死亡指标，包括胞质Fe²⁺蓄积、脂质过氧化、活性氧（ROS）生成及细胞膜损伤；采用蛋白质印迹法分析铁死亡相关蛋白及抗氧化蛋白的表达；通过实时定量PCR（qPCR）定量检测促炎细胞因子的释放。
结果：NaHS预处理显著 attenuated HIV Tat诱导的Fe²⁺蓄积、ROS生成、脂质过氧化及LDH释放。机制上，NaHS抑制了促铁死亡介质酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）及4-羟基壬烯醛（4-HNE），同时恢复了溶质载体家族7成员11（SLC7A11）及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达。此外，NaHS还降低了HIV Tat诱导的IL1β、IL6及TNFα分泌。
结论：上述研究结果表明，H₂S通过抑制铁死亡并恢复细胞稳态，对HIV Tat暴露的小胶质细胞发挥保护作用。综上，H₂S信号通路可作为NeuroHIV相关神经炎症中值得深入探究的潜在机制靶点。

**研究背景与问题提出**

联合抗逆转录病毒疗法（combination antiretroviral therapy, cART）的应用使HIV感染从致死性疾病转变为可管理的慢性状态，全球目前约有3900万HIV感染者。尽管cART能有效抑制外周血中的病毒复制，但中枢神经系统（central nervous system, CNS）内仍存在潜伏病毒库，驱动慢性神经炎症，导致统称为NeuroHIV的神经系统并发症。虽然cART显著降低了HIV相关性痴呆的发病率至1%–2%，但轻度HIV相关神经认知障碍的患病率却有所上升。HIV反式激活因子转录（transactivator of transcription, Tat）蛋白在病毒复制和神经炎症中发挥核心作用，其在HIV感染者脑脊液及死后脑组织中的持续表达凸显了其致病重要性。

在中枢神经系统内，HIV主要通过受染的巨噬细胞和CD4⁺ T细胞进入，进而感染驻留的小胶质细胞——即脑内固有免疫细胞。这些受HIV感染或HIV Tat暴露的小胶质细胞被过度激活，释放神经毒性物质、促炎细胞因子和趋化因子，导致慢性免疫激活和神经元损伤。这一神经炎症级联反应因氧化应激和线粒体功能障碍而加剧，是NeuroHIV致病机制的重要组成部分。在这些细胞过程中，铁稳态失调尤为关键：铁对神经元代谢和小胶质细胞功能不可或缺，但其在胶质细胞中的过量蓄积会促进促炎激活和神经退行性变。过量铁通过催化芬顿反应（Fenton reaction）产生羟自由基，引发氧化损伤和脂质损伤；这种氧化还原失衡导致铁死亡——一种以脂质过化为特征的、铁依赖性的程序性细胞死亡形式。铁死亡的调控涉及促铁死亡损伤与抗铁死亡防御之间的平衡，其中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4, ACSL4）介导的脂质过氧化属于促死亡信号，而溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7-member 11, SLC7A11/xCT）-谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）抗氧化系统则利用谷胱甘肽（glutathione, GSH）清除脂质过氧化物，该轴的破坏使细胞对铁死亡敏感。

新兴研究（包括该课题组前期工作）提示铁死亡参与HIV感染的神经病理机制：此前研究已证实HIV Tat在HIV转基因大鼠及HIV阳性个体死后脑组织中均可诱导小胶质细胞铁死亡。此外，鉴于铁在病毒复制中的重要性，铁螯合剂已被证实可抑制HIV-1生命周期关键阶段。同时，内源性气体信号分子硫化氢（H₂S）在HIV感染期间耗竭，导致氧化应激、炎症失衡及其在神经和心血管系统中正常生理信号功能的改变。H₂S的作用已通过内源性H₂S及外源性供体（如硫氢化钠，即NaHS）进行了研究，后者展现出显著的神经保护特性，主要通过调控小胶质细胞实现。这些保护作用多归因于其升高细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽（关键抗氧化剂）从而对抗氧化应激的能力。此外，NaHS及其他H₂S供体还可调控胱氨酸-谷氨酸转运体。H₂S还直接或间接影响核因子κB（nuclear factor-κappa B, NF-κB）等转录因子的活性，而后者在HIV-1从潜伏期再激活中起关键作用。

鉴于H₂S在调控氧化还原平衡、线粒体生物能量学和炎症反应中的既定作用，研究人员假设NaHS可调节小胶质细胞中HIV Tat诱导的铁死亡。本研究首次阐明了NaHS对HIV Tat诱导的小胶质细胞铁死亡的保护效能。

**主要技术方法**

本研究采用体外细胞实验体系，使用小鼠来源的BV2小胶质细胞系作为研究对象。主要技术方法包括：荧光探针检测法（FerroOrange探针检测胞质Fe²⁺水平；DCFH₂-DA探针检测活性氧；C11-BODIPY 581/591探针检测脂质过氧化程度）、乳酸脱氢酶释放法评估细胞毒性及膜损伤、蛋白质印迹法检测铁死亡相关蛋白（ACSL4、4-HNE、GPX4、SLC7A11、FTH1）表达、免疫荧光显微镜观察蛋白定位与表达变化，以及实时定量PCR技术检测促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNFα）mRNA水平。阳性对照包括：脂多糖（LPS）用于诱导促炎细胞因子、叔丁基过氧化氢（TBHP）用于诱导活性氧生成、RSL3和erastin作为铁死亡诱导剂。

**研究结果**

**3.1 NaHS预处理减轻小胶质细胞中HIV Tat诱导的铁稳态失调**

研究人员首先探究H₂S是否调节HIV Tat诱导的铁失衡。结果显示，NaHS预处理以剂量依赖性方式恢复HIV Tat介导的铁处理蛋白（如GPX4和ACSL4）的失调表达，其中100 μM为最低有效剂量。利用FerroOrange荧光探针检测发现，HIV Tat显著升高胞质游离Fe²⁺水平，而NaHS预处理显著降低HIV Tat介导的Fe²⁺蓄积，部分恢复铁稳态；生化定量进一步证实HIV Tat显著增加不稳定铁池（labile iron pool, LIP），而NaHS预处理使铁水平接近正常对照值。铁死亡诱导剂RSL3同样升高LIP，热灭活Tat则不能改变铁含量。

**3.2 NaHS预处理恢复HIV Tat暴露小胶质细胞的氧化还原稳态**

鉴于过量Fe²⁺可催化芬顿反应生成活性氧，研究人员评估NaHS预处理能否减轻HIV Tat诱导的氧化应激。HIV Tat暴露使BV2细胞中DCFH₂-DA探针检测的活性氧荧光强度显著增加，而NaHS预处理显著抑制HIV Tat诱导的活性氧蓄积，恢复细胞内氧化还原平衡。阳性对照叔丁基过氧化氢强烈上调活性氧生成，验证了检测方法的敏感性。

**3.3 NaHS预处理降低HIV Tat暴露小胶质细胞的脂质过氧化**

由于脂质过氧化是铁死亡的核心标志，研究人员进一步验证NaHS预处理能否逆转HIV Tat诱导的氧化性膜损伤。C11-BODIPY 581/591活细胞成像显示，HIV Tat暴露的BV2细胞发生明显的红色荧光向绿色荧光偏移，提示脂质氧化增加；铁死亡诱导剂erastin产生类似的脂质过氧化效应。相反，NaHS预处理显著下调氧化脂质信号，恢复非氧化膜典型的红色荧光，有效对抗HIV Tat驱动的脂质过氧化并维持小胶质细胞膜完整性。

**3.4 NaHS通过调控铁死亡蛋白表达减轻HIV Tat诱导的铁死亡**

为阐明NaHS是否直接影响铁死亡信号，研究人员检测关键铁死亡相关蛋白表达。蛋白质印迹分析显示，HIV Tat暴露显著增加促铁死亡酶ACSL4及脂质过氧化产物4-HNE水平，同时降低抗氧化酶GPX4；NaHS预处理显著减弱ACSL4和4-HNE表达，并将GPX4水平恢复至接近对照细胞。反映细胞铁储存的铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1, FTH1）表达在HIV Tat暴露的BV2小胶质细胞中保持不变。免疫荧光分析进一步显示，与HIV Tat暴露细胞相比，NaHS预处理条件下GPX4表达显著升高。这些发现证实NaHS通过同时下调促铁死亡介质和强化GPX4依赖性抗氧化防御来抑制HIV Tat诱导的铁死亡。

**3.5 NaHS激活SLC7A11-GPX4轴发挥抗铁死亡保护作用**

由于GPX4活性与其上游调控因子SLC7A11密切相关，研究人员评估NaHS预处理能否调节SLC7A11-GPX4轴。结果显示，HIV Tat和SLC7A11药理学抑制剂erastin暴露均导致SLC7A11表达显著降低；值得注意的是，NaHS预处理在HIV Tat和erastin处理的小胶质细胞中均恢复SLC7A11水平，并伴随GPX4表达上调。免疫荧光成像验证了上述结果：HIV Tat和erastin存在时SLC7A11表达明显降低，而NaHS预处理恢复了HIV Tat和erastin暴露BV2细胞中SLC7A11的表达。

**3.6 NaHS预处理减轻HIV Tat诱导的促炎细胞因子表达、小胶质细胞激活及细胞毒性**

研究人员进一步评估NaHS对HIV Tat诱导促炎细胞因子表达、小胶质细胞激活和细胞毒性的影响。实时定量PCR结果显示，NaHS预处理显著减弱HIV Tat诱导的IL-1β、IL-6和TNFα三种促炎细胞因子mRNA水平上调，提示NaHS介导的铁死亡抑制有效抑制HIV Tat驱动的炎症信号。此外，NaHS预处理显著降低HIV Tat诱导的细胞激活标志物CD11b表达，表明其保护作用延伸至抑制小胶质细胞激活。乳酸脱氢酶释放实验显示，HIV Tat暴露导致细胞外乳酸脱氢酶活性显著增加，提示膜损伤和细胞死亡；而NaHS预处理显著降低乳酸脱氢酶释放，展现其细胞保护潜力。

**讨论与结论**

铁死亡作为一种铁依赖性脂质过氧化驱动的调控性细胞死亡形式，近年来在神经退行性和神经炎症性疾病中的关键作用日益凸显。HIV Tat蛋白通过促进氧化应激、线粒体功能障碍和胶质细胞激活导致神经元损伤。该课题组前期工作表明HIV Tat可在HIV转基因大鼠及HIV阳性个体死后脑组织中诱导小胶质细胞铁死亡，且炎性介质的诱导可能先于铁死亡相关信号的出现。本研究在此基础上进一步鉴定H₂S为能够减轻HIV Tat诱导小胶质细胞铁死亡的有效内源性调节因子。

本研究证实HIV Tat触发BV2小胶质细胞铁死亡，表现为铁蓄积、脂质过氧化及经典铁死亡标志物ACSL4上调；HIV Tat诱导的不稳定铁池增加与抗氧化酶GPX4表达降低相关。H₂S作为与一氧化氮和一氧化碳并列的重要气体信号分子，在神经系统和心血管系统中发挥广泛细胞保护作用。值得注意的是，数项报告表明HIV感染及相关合并症中内源性H₂S水平降低，导致氧化还原信号失调。本研究中，H₂S供体NaHS有效恢复HIV Tat暴露小胶质细胞的氧化还原平衡，显著减弱HIV Tat诱导的Fe²⁺蓄积、限制活性氧产生并阻止氧化性膜损伤，表明H₂S可恢复铁和氧化还原平衡。

本研究的核心发现为NaHS上调SLC7A11-GPX4抗氧化防御轴。HIV Tat暴露和SLC7A11药理学抑制剂erastin均降低SLC7A11表达，从而限制胱氨酸摄取和谷胱甘肽合成；相反，NaHS预处理恢复SLC7A11水平并增加GPX4表达，有效对抗脂质过氧化和细胞死亡。同时ACSL4下调和4-HNE抑制进一步证实NaHS在铁蓄积、脂质过氧化和抗氧化损伤等多个检查点调控铁死亡级联反应，全面保护细胞免受HIV Tat诱导的氧化损伤。需注意NaHS并未显著改变HIV Tat暴露BV2小胶质细胞中的FTH1水平。

除铁死亡外，HIV Tat刺激的小胶质细胞释放促炎介质，促进NeuroHIV更广泛神经炎症微环境形成。NaHS处理降低HIV Tat诱导的细胞毒性（乳酸脱氢酶释放）和促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达，表明其更广泛抗神经炎症效应。脂质过氧化与细胞因子产生的关联在神经炎症中已确立，研究结果提示H₂S可能通过此机制减弱炎症反应。

当前研究明确了HIV Tat通过过量铁蓄积、活性氧生成、脂质过氧化及抑制SLC7A11-GPX4抗氧化轴诱导小胶质细胞铁死亡的机制框架。通过NaHS补充恢复H₂S生物利用度，可有效对抗这些致病事件，调节铁稳态、维持氧化还原平衡并强化抗氧化防御，从而维持小胶质细胞活性和功能完整性。这些发现为考虑H₂S供体或H<sub>2释放化合物作为NeuroHIV辅助疗法提供了充分依据。

研究局限性包括：仅采用单一HIV蛋白（Tat）暴露，未能完全捕捉HIV感染期间病毒蛋白相互作用的复杂性；且仅使用小胶质细胞体外模型，未纳入神经元-胶质细胞共培养系统或更能准确重现中枢神经系统神经免疫环境的在体模型。未来研究将利用体内HIV转基因或猴免疫缺陷病毒模型验证这些保护机制，并确定H2S补充对神经炎症和神经退行性结局的长期影响。特别地，未来研究将利用小胶质细胞特异性SLC7A11和GPX4条件性敲除HIV小鼠模型，从机制上明确H2S-SLC7A11-GPX4轴在HIV相关神经炎症中的作用。

**研究结论**：H2S通过调节铁和氧化还原平衡、下调ACSL4和4-HNE、激活SLC7A11-GPX4抗氧化轴，保护小胶质细胞免受HIV Tat介导的铁死亡。这种对促铁死亡和抗铁死亡机制的双向调控赋予显著的细胞保护作用，可能减轻NeuroHIV中小胶质细胞驱动的神经炎症。因此，以H2S供体靶向铁死亡可能是管理NeuroHIV相关氧化应激和神经炎症的有前景的策略。</sub>