RNS60 在 TDP-43 病理相关肌萎缩侧索硬化症中的神经保护作用

《Muscle & Nerve》：Neuroprotective Effects of RNS60 in TDP-43 Pathology-Associated Amyotrophic Lateral Sclerosis

　　

摘要：TDP-43（TAR DNA结合蛋白43）病理广泛见于肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者大脑皮层。RNS60 是一种用于急性缺血性卒中和 ALS 的实验性制剂，在其他临床前模型中可增强线粒体生物发生及功能。研究人员探究了 RNS60 能否改善 TDP-43 小鼠模型 ALS 中的线粒体稳定性及上运动神经元（UMN）健康。方法：prpTDP-43A315T-UeGFP 小鼠（其上运动神经元表达绿色荧光蛋白 eGFP）及 WT-UeGFP 小鼠，从出生后第30天（P30）至 P90 每隔一日腹腔注射 RNS60 或安慰剂。通过免疫细胞化学定量脑和脊髓星形胶质细胞增生及小胶质细胞活化；电镜观察线粒体超微结构；流式细胞术评估线粒体功能；评估腓肠肌、胫骨前肌及膈肌的神经肌肉接头（NMJ）完整性。结果：RNS60 处理降低了上运动神经元（prpTDP-43A315T＋vehicle：53.2%±0.71%；prpTDP-43A315T＋RNS60：19.6%±1.4%，p＝0.0001）及脊髓运动神经元中缺陷线粒体比例，提高了线粒体膜电位（prpTDP-43A315T-UeGFP＋vehicle：7184±1689 平均荧光强度；prpTDP-43A315T-UeGFP＋RNS60：22120±4818，p＝0.032），减少了运动皮层和脊髓的星形胶质细胞与小胶质细胞活化，保护了上运动神经元，并提高了肢体及膈肌完整 NMJ 比例（prpTDP-43A315T-UeGFP＋vehicle：29.6%±3.6%；prpTDP-43A315T-UeGFP＋RNS60：64.3%±4.4%，p＝0.0002）。结论：RNS60 通过保护线粒体结构与功能、维持 NMJ 完整性及减轻胶质增生，促进 ALS 模型中的运动神经元健康。

论文解读：RNS60 在 TDP-43 病理相关肌萎缩侧索硬化症中的神经保护作用

研究背景与目的

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种致死性神经退行性疾病，约97%的散发及家族性ALS患者存在TDP-43（TAR DNA-binding Protein 43）蛋白胞内聚集及功能紊乱，其特征性表现之一是线粒体功能障碍——包括线粒体嵴（cristae）结构破坏、膜电位下降及线粒体聚集。目前ALS尚无治愈手段，现有疗法难以同时针对多系统病理改变。上运动神经元（Upper Motor Neuron, UMN）退化是ALS早期重要事件，但在既往研究中常被忽视。prpTDP-43^A315T转基因小鼠可重现ALS患者UMN的TDP-43病理、广泛胶质增生及线粒体缺陷，是合适的药物评价模型。RNS60是一种经特殊Taylor-Couette-Poiseuille流处理的富氧生理盐水（溶解氧40–60 mg/L），在缺血性脑卒中及SOD1^G93AALS模型中显示抗炎及神经保护作用，并可激活神经元线粒体生物发生。本研究旨在明确RNS60能否在TDP-43^A315TALS小鼠模型中保护UMN线粒体结构与功能、减轻胶质增生并维持神经肌肉接头（Neuromuscular Junction, NMJ）完整性，探讨其对TDP-43相关ALS的治疗潜力。本研究发表于《Muscle & Nerve》。

主要技术方法

研究人员使用C57BL/6J背景的prpTDP-43^A315T转基因小鼠与UCHL1-eGFP（UeGFP）小鼠交配获得prpTDP-43^A315T-UeGFP小鼠，使皮质UMN特异性表达eGFP以便分选鉴定。实验动物从出生后第30天（P30）至P90隔日腹腔注射RNS60（300 μL）或0.9%生理盐水对照。主要技术手段包括：（1）免疫荧光细胞化学定量运动皮层及腰髓腹角GFAP⁺星形胶质细胞与Iba1⁺小胶质细胞数目；（2）免疫金标记结合透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察并量化UMN及脊髓运动神经元（Spinal Motor Neuron, SMN）线粒体总数、具嵴完整线粒体百分比及线粒体聚集体数目；（3）原代皮质细胞解离后TMRE（Tetramethylrhodamine Ethyl Ester）染色结合流式细胞术检测eGFP⁺UMN线粒体膜电位；（4）腓肠肌、胫骨前肌及膈肌冰冻切片α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）染运动终板、抗UCHL1染轴突末梢，共聚焦显微镜评估完整NMJ比例。统计学采用Student t检验或单因素ANOVA及Tukey事后检验，分析者设盲。

研究结果

3.1 RNS60 Treatment Reduces Gliosis（RNS60处理减少胶质增生）

通过计数运动皮层及脊髓Iba1⁺小胶质细胞和GFAP⁺星形胶质细胞，研究发现prpTDP-43^A315T-UeGFP小鼠vehicle组运动皮层活化的小胶质细胞（33.5±1.43）及星形胶质细胞（29.9±2.27）显著多于WT对照组；RNS60处理后两者分别降至9.28±0.96和15.1±2.15（均p＝0.0001），接近WT水平。脊髓水平亦观察到RNS60显著降低prpTDP-43^A315T小鼠中小胶质细胞（40.3→22.9，p＝0.0004）及星形胶质细胞（53.9→26.7，p＜0.05）活化。WT小鼠无论是否接受RNS60，胶质细胞数目无差异。结论：RNS60选择性抑制TDP-43病理诱导的中枢神经系统胶质增生。

3.2 RNS60 Treatment Preserves UMNs in the Motor Cortex（RNS60保护运动皮层上运动神经元）

计数M1运动皮层eGFP⁺UMN，prpTDP-43^A315Tvehicle组UMN数量（53.7±0.89）较WT（83.4±2）显著减少；RNS60处理使prpTDP-43^A315T小鼠UMN恢复至78.6±1.87（p＝0.0001 vs vehicle），与WT无显著差异。腰髓SMN在各基因型及治疗组间数量无显著差异（与本模型不表现明显SMN丢失特征一致）。结论：RNS60可挽救TDP-43病理导致的UMN丢失。

3.3 RNS60 Treatment Improves Mitochondrial Ultrastructure in Diseased UMNs（RNS60改善病变上运动神经元线粒体超微结构）

电镜分析显示，prpTDP-43^A315Tvehicle组UMN中线粒体嵴缺陷比例达53.2%±0.71%，RNS60降至19.6%±1.4%（p＝0.0001）；线粒体聚集体从4.83±0.21减至1.46±0.04（p＝0.0004）。SMN中缺陷嵴比例从70.1%±4.48%降至33.5%±4.43%（p＝0.001），聚集体从5.52±0.51降至3.44±0.4（p＝0.03）。各组总线粒体数无变化。结论：RNS60恢复TDP-43病理下运动神经元线粒体内嵴完整性并减少异常聚集，但不影响线粒体总数。

3.4 RNS60 Improves Mitochondrial Function in Diseased UMNs（RNS60改善病变上运动神经元线粒体功能）

流式细胞术检测TMRE荧光强度反映线粒体膜电位。prpTDP-43^A315Tvehicle组eGFP⁺UMN中TMRE强度（7184±1689）显著低于WT（21366±3320，p＝0.028）；RNS60处理使其回升至22120±4818（p＝0.032 vs vehicle），与WT相当。结论：RNS60改善TDP-43背景下UMN线粒体功能，与其超微结构保护相符。

3.5 RNS60 Improves NMJ Integrity（RNS60改善神经肌肉接头完整性）

评估肢体（腓肠肌、胫骨前肌）及膈肌NMJ完整性（轴突-UCHL1与终板-α-bungarotoxin完全重叠为完整）。prpTDP-43^A315Tvehicle组腓肠肌完整NMJ仅18.3%±2.6%（WT 91.9%），RNS60提升至76.5%±5.1%（p＝0.0001）；胫骨前肌从20%±2.9%升至78.5%±2.4%（p＜0.0001）；膈肌从29.6%±3.6%升至64.3%±4.4%（p＝0.0002），接近WT水平。结论：RNS60显著保护外周NMJ退化，尤以对呼吸至关重要的膈肌NMJ为著。

讨论与结论总结

研究人员指出，TDP-43异常导致线粒体tRNA/前体RNA结合异常、MFN2（Mitofusin 2）相关毒性及mtDNA泄漏引发炎症，而RNS60通过维护线粒体嵴结构与膜电位、减轻运动皮层与脊髓胶质炎性反应、保护UMN存活，进而维持下游NMJ完整性——尤其膈肌NMJ的改善可能为既往II期临床中RNS60减缓ALS患者用力肺活量（FVC）下降并提供生存获益提供了机制解释。与先前SOD1^G93A模型结果一致，RNS60具多靶点神经保护特性，适合进一步在ALS及其他TDP-43蛋白病中探索。

研究结论（翻译）：

本研究表明，RNS60处理可改善TDP-43病理相关ALS小鼠模型中运动神经元的线粒体结构完整性与功能、减轻胶质增生、并提高三个不同肌群中的神经肌肉接头完整性。这被推测可通过整体改善运动神经元健康发挥作用，且具有重要意义——因为TDP-43病理见于近97%散发及家族性ALS患者并与线粒体缺陷相关联。