丙戊酸诱导神经管缺陷小鼠的肠神经系统结构异常与胃肠运动功能障碍

《Neurogastroenterology & Motility》：Abnormal Enteric Nervous System Organization and Gastrointestinal Motility in Mice With Valproic Acid-Induced Neural Tube Defects

　　

神经管缺陷（NTDs）是一种常见的先天性出生缺陷，可发生于颅部水平导致无脑畸形，或发生于脊髓水平导致脊柱裂。神经源性肠病是脊柱裂患者发病的主要原因，但尚不清楚胃肠道（GI）是否在其他类型的神经管缺陷中受累。胃肠运动的绝对必要条件是位于胃肠道壁内的肠神经系统（ENS）。在胚胎期、胎儿期及早期产后发育过程中，肠神经元聚合成环向条纹，这种ENS逐步组织化为肠神经元条纹的过程与神经源性胃肠运动的出现相关。研究人员假设神经管缺陷与ENS组织化改变相关，且这些改变与特定的胃肠运动缺陷相关。研究人员采用产前丙戊酸（VPA）暴露诱导小鼠胎儿露脑畸形（一种颅部神经管缺陷），并利用免疫组织化学、高分辨率共聚焦成像及离体运动功能测定评估神经管缺陷胎儿肠神经元条纹及胃肠运动。结果显示，丙戊酸诱导神经管缺陷胎儿的胃肠道内含血；结构上，肠神经元条纹更薄且条纹间距更窄，导致条纹数量增加；功能上，胃肠运动异常，表现为收缩频率增加及收缩节段长度增加。研究结论为，丙戊酸诱导神经管缺陷小鼠胎儿中ENS组织化与胃肠运动均受到破坏，这对理解脊柱裂等中枢神经系统疾病中神经源性肠病的发病机制具有重要启示意义。

神经管缺陷（NTDs）是最常见的中枢神经系统（CNS）先天性畸形，每年影响全球数十万例妊娠。颅部神经管闭合缺陷导致发育中的脑组织膨出（露脑畸形），随后暴露的神经组织退化导致无脑畸形；脊髓神经管闭合缺陷则导致脊髓脊膜膨出，即脊柱裂。神经源性肠病泛指由神经系统疾病引起的胃肠道（GI）功能障碍，是脊柱裂患者发病的主要原因之一。然而，无脑畸形患者在发育过程中是否存在胃肠道功能障碍尚未得到评估。

虽然神经源性肠病常见于影响中枢神经系统的疾病，但近年来研究关注点逐渐转向肠神经系统（ENS），即位于肠壁内负责胃肠运动的外周神经系统组成部分。ENS来源于神经嵴细胞，这些细胞在神经管闭合期间于神经板边界处被指定。迷走神经嵴细胞进入胃肠道并沿近端向远端迁移，分化为肠神经元并定殖于整个胃肠道；骶神经嵴细胞 additionally 参与结肠ENS的构成。在无脑畸形胎儿中，ENS的组织学研究显示肠神经元密度降低；类似地，脊柱裂患者的ENS神经纤维更细且肠神经元密度降低。为探究ENS是否参与神经管缺陷相关的胃肠功能障碍，研究人员在本研究中评估了神经管缺陷小鼠模型中ENS的组织化特征，并同步检测了胃肠运动功能。

ENS由胃肠道壁内两种截然不同的神经丛组成。肌间神经丛中的神经元聚集形成神经节，镶嵌于两层肌肉之间，调控胃肠运动。研究人员此前已证实，在胚胎期和胎儿期发育过程中，肌间神经节排列成环向条纹，且这种肠神经元条纹组织化在胃肠道不同区域具有特异性，在小鼠和人类中均是如此。在小鼠中，肌间神经元的生成高峰为胚胎第10.5天（E10.5）至E14.5。神经元最初呈分散分布，但逐渐聚合成越来越明确的条纹。肠神经元条纹在E18.5时于近端胃肠道变得清晰，而在远端胃肠道则于产后发育过程中形成。肠神经元条纹形成的时序性与小肠中协调的神经源性胃肠运动的出现相关：E16.5时出现簇状波纹，E18.5时出现传播性收缩复合波。因此，研究人员提出科学问题：神经管缺陷小鼠的肠神经元条纹是否受到破坏，从而可能导致胃肠功能障碍。

丙戊酸（VPA）等致畸药物的暴露是神经管缺陷的明确病因之一，该药常以Depakote或Depakene为商品名处方，用于治疗癫痫、偏头痛和双相情感障碍。妊娠期VPA暴露可使神经管缺陷风险增加5-20倍。妊娠期VPA暴露也是啮齿类动物神经管缺陷的成熟模型。在小鼠中，神经管发育期间暴露于VPA可诱导露脑畸形表型的神经管缺陷。大鼠产前VPA暴露虽与ENS结构改变及胃肠运动减慢相关，但这些幼鼠并无神经管缺陷。

本研究首先建立了VPA诱导神经管缺陷的小鼠模型。在瑞士韦伯斯特小鼠中，E8.5给予单次400 mg/kg VPA腹腔注射，约三分之一暴露胎儿在E16.5或E18.5时表现为露脑畸形，与既往文献报道一致。虽然各窝受影响胎儿比例变异较大，但几乎所有窝均至少有1只受影响胎儿。研究人员发现雌性胎儿更易发生露脑畸形（58.33%雌性受影响 vs 33.33%雄性，p=0.04），这与Brown等发现的400 mg/kg剂量下雌雄敏感性差异不同，可能与使用瑞士韦伯斯特品系（本研究）而非CD-1品系有关。研究结果确认了400 mg/kg产前VPA暴露作为神经管缺陷可靠模型的适用性。

研究人员随后观察了VPA诱导神经管缺陷胎儿（VPA-NTD）的胃肠道大体形态。在E16.5时，VPA-NTD胎儿小肠长度短于VPA暴露但未发生神经管缺陷的胎儿（VPA-noNTD），但与对照组无显著差异；该差异在E18.5时消失，此时VPA-NTD胎儿小肠长度反而显著长于VPA-noNTD胎儿，与对照组无差异。结肠长度在各组间无显著差异。重要的是，研究人员发现所有VPA-NTD胎儿在E18.5时胃肠道腔内均存在血液，而E16.5时VPA-NTD胎儿及E16.5和E18.5时VPA-noNTD胎儿均无此现象。血液主要分布于胃及近端胃肠道。为探究血液来源，研究人员通过免疫组织化学评估了胃肠道分层结构，未发现VPA-NTD与对照组之间的显著差异；然而，VPA-NTD胎儿的羊膜囊中存在血液，而对照组和VPA-noNTD胎儿则无。羊膜出血最早可见于E16.5，早于胃肠道内血液出现2天。鉴于小鼠胎儿E14.5即出现张口动作，研究人员推测胎儿可能吞咽了羊膜囊中的血液。

在ENS结构评估方面，研究人员采用HuC/D免疫组织化学标记结合高分辨率共聚焦成像技术，对E18.5时肠神经元条纹进行了定量分析。结果显示，VPA-NTD胎儿十二指肠和空肠中肠神经元条纹仍然存在，但组织化特征发生改变：条纹更薄（十二指肠VPA-NTD均值44.8 μm vs 对照组50.6 μm），条纹间距缩短约30%（十二指肠）和20%（空肠），导致单位面积内条纹数量增加约30%（十二指肠）和20%（空肠）。通过最近邻距离测量评估的神经元分布显示，VPA-NTD与对照组同样呈高度聚集状态，符合条纹化模式。神经元总数在VPA-NTD胎儿十二指肠和空肠中增加约20%，但远端肠段无显著差异。VPA-noNTD胎儿在多数指标上与对照组无显著差异。

在胃肠运动功能方面，研究人员采用离体运动监测系统评估了E18.5时自主ENS介导的胃肠运动。通过生成时空图（STMs）定量分析发现：VPA-NTD胎儿十二指肠收缩频率约为对照组的两倍（对照组均值2.5次/分钟 vs VPA-NTD 4.6次/分钟），但空肠收缩频率无显著差异；收缩节段长度在VPA-NTD胎儿十二指肠延长约50%（对照组均值0.44 cm vs VPA-NTD 0.68 cm），空肠延长约80%（对照组均值0.40 cm vs VPA-NTD 0.74 cm）。VPA-noNTD胎儿与对照组相比无显著运动功能差异。

在讨论部分，研究人员首先阐述了研究的临床相关性：VPA暴露是神经管 defects 的临床相关模型，鉴于育龄期女性VPA暴露的普遍性。关于雌雄敏感性差异，本研究与Brown等结果的部分差异可归因于小鼠品系不同，且雌性小鼠在多基因模型中对露脑畸形的易感性增高，这与人类历史上无脑畸形女性多发的情况一致，尽管叶酸强化后该性别差异已减弱。

研究人员重点分析了肠神经元条纹与胃肠运动的关联。肠神经元条纹的出现与协调神经源性胃肠运动的发展相关。本研究发现VPA-NTD胎儿中条纹结构改变与胃肠运动异常同时存在，且不同肠段效应各异：十二指肠条纹宽度变窄伴随收缩频率增加，而空肠无条纹宽度改变但收缩节段长度增加。这提示肠神经元条纹的特定特征可能影响特定运动模式，例如条纹宽度可能影响收缩频率。尚需进一步研究明确细胞类型分布或神经元连接性等其他因素是否也发生改变。

VPA-NTD与VPA-noNTD胎儿之间的差异表明，神经元数量、肠神经元条纹结构和胃肠运动的改变特异性地与神经管缺陷的存在相关，而非单纯由VPA暴露引起。VPA-noNTD胎儿空肠中神经元稍分散的原因尚不清楚，可能部分归因于VPA的全组织暴露效应或瑞士韦伯斯特品系的遗传变异。未来采用其他致畸剂或神经管缺陷遗传模型的研究将进一步阐明神经管缺陷与ENS组织化的关系。

关于神经管缺陷影响ENS发育的机制，研究人员排除了神经嵴细胞迁移障碍的可能性，因为VPA-NTD胎儿结肠神经元数量与对照组相当，不支持近端向远端迁移受损。VPA对小肠神经发生的影响尚不能完全排除。鉴于肠神经嵴细胞在神经胚形成期间于神经板边界区域被指定，开放的神经管理论上可能影响早期肠神经嵴细胞发育，但无脑畸形通常为 forebrain水平缺陷，而非 hindbrain水平。需要 future studies 明确神经管缺陷对早期肠神经嵴细胞发育的影响。

关于胃肠运动的神经调控，研究人员指出虽然迷走神经和脊髓神经的外源性支配参与调节胃肠运动，但本研究中离体条件下观察到的运动异常提示ENS内在功能障碍而非外源性神经支配异常起主要作用。

羊膜出血和胃肠道内血液的意外发现是本研究的重要附带结果。羊膜出血与VPA诱导的神经管缺陷直接相关，符合露脑畸形自然病程中暴露神经组织出血性坏死的病理过程。胃肠道内血液可能通过吞咽进入，其是否直接 contribute to 胃肠运动改变尚不确定。鉴于E12.5时感觉神经元已存在，肠神经元可能感知血液与胎粪之间的物理特性差异。成人豚鼠结肠研究表明，肠腔内容物的机械特性影响胃肠运动。因此，不能排除吞咽血液和组织碎片与VPA-NTD胎儿胃肠运动差异存在因果关联。

研究结论：丙戊酸诱导神经管缺陷小鼠的肠神经系统结构和胃肠功能均受到破坏。这对于理解包括脊柱裂在内的中枢神经系统疾病患者中神经源性肠病的发病基础具有重要启示意义。