靶向脂质组学分析hPheo1与SDHB KD细胞揭示多胺通路抑制后生物活性脂质和蛋白激酶C（PKC）的变化

《Physiological Reports》：Targeted lipidomics between hPheo1 and SDHB KD cells reveal changes in bioactive lipids and PKC with polyamine pathway inhibition

　　

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中携带琥珀酸脱氢酶B亚基（SDHB）致病性变异与显著的转移风险相关。多胺通路抑制剂N¹,N¹¹-二乙基去甲精胺（DENSPM）先前被证明可抑制来源于人嗜铬细胞瘤（hPheo1）的祖细胞的细胞生长。在此，研究人员假设DENSPM处理引起的细胞死亡与脂质代谢改变影响蛋白激酶C（PKC）有关。通过靶向脂质组学分析，基线状态下hPheo1 WT与SDHB KD细胞之间差异的生物活性脂质为PE(P-18:1/16:0)、PI(18:1/20:3)、LPE(18:0)和LPE(22:4)。经DENSPM处理后，hPheo1 WT和SDHB KD细胞中多种缩醛磷脂酰乙醇胺（PE-O）、鞘磷脂（SM）和己糖神经酰胺（HCER）的浓度升高，而多种缩醛磷脂酰乙醇胺（PE-P）的浓度降低。与hPheo1 WT细胞相比，SDHB KD细胞中DENSPM处理后相对于溶剂处理的PE-Ps、PE-Os和SMs的变化更大。SDHB KD细胞中基础PKCα蛋白表达高于hPheo1 WT细胞。两种细胞系中PKCα和PKCδ的蛋白表达在DENSPM处理后均显著降低。DENSPM改变了pro-caspase-3和cleaved caspase-3。这些数据表明醚磷脂是通过PKC依赖性机制介导DENSPM诱导细胞凋亡的生物标志物。

**论文解读：靶向脂质组学揭示DENSPM通过调节醚磷脂和PKC诱导hPheo1及SDHB KD细胞凋亡**

**1. 研究背景与意义**

嗜铬细胞瘤（PCC）和副神经节瘤（PGL）均为罕见的神经内分泌肿瘤。其中，携带琥珀酸脱氢酶B亚基（SDHB）基因突变的患者发生转移性疾病的概率显著升高，且转移性肿瘤通常表现为晚期，治疗选择极为有限。多胺是带阳离子的多聚胺，在离子通道调节、受体功能、蛋白质合成、细胞增殖及分化中发挥重要作用。细胞内多胺水平升高与多种肿瘤的发生密切相关。因此，多胺通路已成为抑制癌细胞生长的潜在治疗靶点。多胺类似物N¹,N¹¹-二乙基去甲精胺（DENSPM）已被证明可在人嗜铬细胞瘤细胞系hPheo1及异种移植小鼠模型中抑制细胞生长。机制上，DENSPM可诱导多胺分解代谢酶——精脒/精胺N¹-乙酰转移酶（SSAT）活性，促进精胺和精脒转化为乙酰化形式，进而产生H₂O₂引发氧化应激和细胞死亡。此外，DENSPM还可导致微管塌陷、异常mTOR蛋白表达及激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。然而，DENSPM是否通过调节细胞膜中生物活性脂质影响细胞信号传导（特别是蛋白激酶C，PKC），在人类PCC衍生细胞中尚未得到研究。生物活性脂质如磷脂酰乙醇胺（PE）及其醚脂形式（缩醛磷脂，PE-P和缩醛磷脂酰乙醇胺，PE-O）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）在细胞膜功能及癌症进展中起关键作用。SDHB基因突变可导致代谢重编程，可能改变膜脂质组成。本研究旨在验证假设：DENSPM通过改变膜中生物活性脂质浓度、调节PKC表达及凋亡标志物来发挥抗癌作用。该研究发表于《Physiological Reports》。

**2. 主要关键技术与方法**

为探究上述假说，研究人员采用了以下核心技术方法：
- **细胞模型**：使用人PCC来源的hPheo1野生型（WT）细胞（女性，具有NF-1驱动突变，代表Cluster 2突变）及其SDHB敲低（SDHB KD）细胞（女性，代表Cluster 1突变）。所有实验使用至少3个不同代次的细胞。
- **靶向脂质组学分析**：细胞经10 μM DENSPM或溶剂处理72小时后，收集细胞裂解液并超速离心获取膜组分。采用Bligh和Dyer法提取脂质，加入EquiSPLASH内标混合物。脂质提取物通过超高效液相色谱（UHPLC）联用QTRAP三重四极杆质谱（MS/MS）进行分析，使用Luna NH₂柱梯度洗脱，并以多反应监测（MRM）模式在正负离子模式下采集数据。定量数据经中位数归一化和帕累托缩放后，通过单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验比较组间差异（p<0.05）。
- **蛋白免疫印迹（Western blot）**：膜组分蛋白经SDS-PAGE分离后转膜，使用特异性抗体检测pro-caspase-3、cleaved caspase-3、PKCα、PKCδ、PKCε及PKCζ的表达，以丽春红染色作为上样对照，并进行光密度分析。
- **免疫荧光显微镜**：细胞经甲醇/丙酮固定后，使用相应一抗及二抗孵育，封片后于Olympus显微镜下成像。
- **MTT细胞增殖实验**：以不同密度接种细胞，24小时后加入MTT试剂，孵育后溶解结晶，于570 nm测定吸光度，以评估细胞增殖率。

**3. 研究结果**

**3.1 hPheo1与SDHB KD细胞增殖能力评估**
MTT实验显示，在不同接种密度下，SDHB KD细胞的增殖速率均高于hPheo1 WT细胞。

**3.2 基线状态下hPheo1 WT与SDHB KD细胞膜脂质丰度差异**
脂质组学热图分析表明，在基线条件下，hPheo1 WT与SDHB KD细胞膜组分中多种脂质存在差异（p<0.001）。其中，具有显著区别的生物活性脂质包括PE(P-18:1/16:0)、PI(18:1/20:3)、LPE(18:0)和LPE(22:4)。

**3.3 DENSPM处理后hPheo1 WT与SDHB KD细胞膜脂质丰度变化**
半定量脂质组学显示，与溶剂处理相比，DENSPM处理可上调或下调多种脂质类别的浓度。热图展示了50种在两组处理间及两种细胞系间差异最显著的脂质。

**3.4 DENSPM处理降低PE-P而升高PE-O**
与溶剂处理相比，DENSPM处理后，hPheo1 WT和SDHB KD细胞中多种缩醛磷脂酰乙醇胺（PE-P）[包括PE(P-16:0/20:2)、PE(P-16:0/18:3)、PE(P-16:0/16:1)、PE(P-18:1/16:1)]的浓度显著降低。反之，多种缩醛磷脂酰乙醇胺（PE-O）[包括PE(O-18:0/20:4)和PE(O-18:0/22:6)]的浓度显著升高。且上述变化在SDHB KD细胞中较hPheo1 WT细胞更为显著（p<0.01或p<0.001）。

**3.5 DENSPM处理增加鞘磷脂（SM）浓度**
DENSPM处理使hPheo1 WT和SDHB KD细胞中SM(24:0)、SM(18:0)、SM(26:0)的浓度升高。与溶剂处理相比，DENSPM处理的SDHB KD细胞中SM升幅较hPheo1 WT细胞更大（p<0.05或p<0.001）。

**3.6 DENSPM处理增加己糖神经酰胺（HCER）浓度**
DENSPM处理显著增加了两种细胞中HCER(22:0)和HCER(22:1)的浓度。对于HCER(22:0)，SDHB KD细胞中DENSPM引起的升高幅度大于hPheo1 WT细胞（p<0.01）。

**3.7 DENSPM处理降低pro-caspase-3并升高cleaved caspase-3**
Western blot结果显示，与溶剂处理相比，DENSPM处理的SDHB KD细胞中pro-caspase-3蛋白表达显著降低，同时cleaved caspase-3表达升高；hPheo1 WT细胞中亦呈现相同趋势（p<0.05或p<0.01）。表明DENSPM诱导了caspase-3依赖性凋亡。

**3.8 DENSPM处理降低PKCα和PKCδ蛋白表达**
基线状态下，SDHB KD细胞中PKCα蛋白表达高于hPheo1 WT细胞（p<0.05）。DENSPM处理后，两种细胞中PKCα和PKCδ的蛋白表达均较溶剂处理降低（PKCα在hPheo1中p<0.05，SDHB KD中未达统计学差异；PKCδ在两种细胞中均p<0.05）。而PKCε和PKCζ的表达在两组间无显著差异。

**4. 总结与讨论**

研究人员通过靶向脂质组学与蛋白表达分析发现，多胺通路抑制剂DENSPM可显著改变hPheo1 WT和SDHB KD细胞膜中多种生物活性脂质的浓度，特别是选择性地降低缩醛磷脂酰乙醇胺（PE-P）、升高缩醛磷脂酰乙醇胺（PE-O）、鞘磷脂（SM）及己糖神经酰胺（HCER）。这些脂质变化与PKCα和PKCδ蛋白表达下调及caspase-3活化介导的凋亡同步发生。由于SDHB KD细胞中DENSPM造成的脂质浓度变化幅度更大，且其基础PKCα表达更高，研究人员推测DENSPM可能对SDHB突变肿瘤更具治疗潜力。研究结论强调，醚磷脂（尤其是PE-O与PE-P的失衡）可作为DENSPM通过PKC依赖性机制诱导细胞凋亡的生物标志物。该研究首次在人PCC衍生细胞中系统评估了DENSPM对膜脂组和PKC通路的影响，为后续基于SDHB突变的PCPG患者临床试验提供了脂质学依据。局限性在于未使用PCPG组织样本及动物模型进行体内验证，未来计划利用SDHB缺陷小鼠模型进一步探索DENSPM的脂质调控机制。