《International Wound Journal》：The In Vitro Wound-Scratch Assay: Applications, Technical Advances, and Limitations in Wound Healing Research
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伤口划痕实验是一种广泛使用的体外（in vitro）模型，用于研究集体细胞迁移，这是促进伤口闭合和再上皮化（re-epithelialisation）的基本过程。由于其简单、低成本和高适应性，它已成为早期伤口愈合研究和治疗筛选的基础工具。该实验包括在融合细胞单
伤口划痕实验是一种广泛使用的体外（in vitro）模型，用于研究集体细胞迁移，这是促进伤口闭合和再上皮化（re-epithelialisation）的基本过程。由于其简单、低成本和高适应性，它已成为早期伤口愈合研究和治疗筛选的基础工具。该实验包括在融合细胞单层中产生一个定义明确的间隙，并随时间监测间隙闭合作为修复的替代读数。这篇叙述性综述审查了199篇已发表的研究，确定了73篇与伤口愈合相关。在三个主要类别中确定了伤口创建方法的技术层级：机械方法（例如，移液器吸头和细胞刮刀），可访问但容易出现操作者依赖性变异；半自动化系统（例如，插入物和伤口制造装置），提高了可重复性；以及提供高精度和高通量能力的全自动化机器人平台。虽然这些进展提高了技术一致性，但它们并未克服实验的基本生物学限制。重要的是，伤口划痕实验中的间隙闭合主要反映平面集体细胞迁移，并不能重现控制体内（in vivo）伤口修复的综合炎症、血管、代谢和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）依赖性过程。因此，通过仅迁移读数评估时，通过抗氧化、抗炎、促血管生成或基质调节途径作用的生物活性化合物可能会被低估或错误分类。研究人员提供了初步的内部（未发表）数据来说明这一局限性，显示出对在体内（in vivo）具有已确立伤口愈合活性的化合物只有适度的迁移效应。尽管存在这些限制，当适当解释时，伤口划痕实验仍然是一种有价值的第一线假设生成工具，其未来效用取决于与适应模型和补充实验的整合以进行转化。
伤口划痕实验是评估集体细胞迁移的简便、低成本的体外（in vitro）模型，其核心步骤包括在融合细胞单层中制造可控间隙并监测闭合过程。该模型广泛应用于伤口愈合研究的早期阶段和治疗筛选，但主要局限于平面迁移，无法重现体内（in vivo）伤口修复中复杂的炎症、血管、代谢和细胞外基质（ECM）依赖性过程。本文通过对1999年至2025年间199篇文献的分析（其中73篇直接相关），系统总结了伤口创建方法的技术层级：机械方法（如移液器吸头、细胞刮刀）简单易行但操作者依赖性大；半自动化系统（如硅胶插入物、伤口制造装置）提高了可重复性；全自动化机器人平台则提供高精度和高通量（high-throughput, HTS）能力。然而，技术改进未能克服模型的生物学局限性：基于纯迁移读出的评估可能低估抗氧化、抗炎或血管生成类化合物的治疗潜力，这一点通过未发表初步数据（如表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、熊果苷、海藻糖对成纤维细胞迁移的微弱影响）得以印证。
**1 引言**
伤口愈合涉及止血、炎症、增殖和重塑四个重叠阶段，依赖于成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞和免疫细胞的协调作用。慢性伤口（如糖尿病足、静脉溃疡）常因细胞反应受损而延迟愈合，需要创新治疗策略。标准体外（in vitro）模型（如伤口划痕实验）通常无法复制复杂的伤口微环境，可能导致误导性结果。
**1.1 伤口愈合：概述**
止血阶段立即启动，血小板聚集并释放血小板源性生长因子（PDGF）和转化生长因子-β（TGF-β），形成纤维蛋白临时基质。炎症阶段以血管扩张、中性粒细胞和巨噬细胞浸润为特征，这些细胞清除病原体并分泌活性氧（ROS）及血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）等。增殖阶段中，成纤维细胞合成ECM成分（胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白），VEGF驱动血管新生，角质形成细胞迁移完成再上皮化。重塑阶段持续数周至数月，肌成纤维细胞介导伤口收缩，胶原重组以增加组织强度。修复组织的拉伸强度和功能通常无法达到未损伤组织水平。伤口愈合结局受年龄、营养、基础疾病、感染和机械应力等内外因素影响。慢性高血糖、晚期糖基化终末产物（AGEs）、持续氧化应激和细胞衰老等新近认识到的驱动因素强调需要生理相关性实验模型。
**1.2 伤口划痕实验：一种有价值的体外工具**
该实验通过在融合细胞单层（通常为成纤维细胞或角质形成细胞）中制造可控间隙，利用定时或延时成像监测闭合过程。闭合速率反映细胞迁移和增殖的协同作用，常通过丝裂霉素C等抑制剂平行实验区分二者。该工具可在进入更复杂的3D体外（in vitro）、离体（ex vivo）和体内（in vivo）模型前，定量评估化合物对伤口愈合的影响。
**1.3 伤口划痕实验在伤口愈合研究中的应用**
**1.3.1 筛选潜在治疗药物**
该模型用于快速评估候选化合物（如生长因子、细胞因子、小分子、天然提取物）对细胞迁移和伤口闭合的促进作用。例如，EGF、成纤维细胞生长因子（FGF）和TGF-β刺激角化细胞和成纤维细胞迁移；白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）调节炎症反应；他汀类药物和二甲双胍促进内皮细胞迁移；芦荟、姜黄素和蜂蜜等天然提取物显示促迁移活性。实验还可确定最佳治疗浓度并适应高通量筛选（HTS）。然而，该实验对仅以抗氧化或抗炎机制为主的化合物敏感性有限，常需二次验证。
**1.3.2 探索伤口愈合机制**
该模型用于研究ECM成分（胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白）对细胞黏附和迁移的影响，以及基质金属蛋白酶（MMPs）在ECM降解和重塑中的作用。此外，缺氧条件下可模拟缺血性伤口，探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对成纤维细胞迁移的作用；氧化应激和内皮细胞迁移研究有助于理解糖尿病伤口愈合障碍。该模型虽无法完全复制体内免疫、血管化和基质重塑的复杂性，但常与补充分子和生理模型结合，以更全面理解愈合通路。
**2 病理状况对伤口愈合的影响（通过划痕实验评估）**
糖尿病、慢性炎症和衰老等病理状况可显著损害伤口愈合。划痕实验通过调整培养条件（如高糖、炎症混合液）模拟这些病变，研究细胞功能缺陷（如间隙闭合延迟）。
**2.1 糖尿病**
高糖环境（25–30 mM葡萄糖，常联合100 μM甲基乙二醛）损伤内皮细胞（如人脐静脉内皮细胞（HUVECs））、角质形成细胞和人真皮成纤维细胞（HDF）的迁移。150 mM高糖显著降低迁移能力。选择生理相关葡萄糖浓度至关重要，以避免伪影（高浓度可能过高估计损伤）。
**2.2 慢性炎症**
慢性伤口表现为持续炎症。Yeo等使用含干扰素-γ（IFN-γ）、佛波酯（PMA）和脂多糖（LPS）的炎症培养基处理HDF和角质形成细胞（HaCaT），显著延迟划痕闭合。Aw等发现该刺激诱导TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17和CXCL-10等促炎细胞因子显著升高，且成纤维细胞表现出更广泛的细胞因子上调（39种 vs 角化细胞16种）。这些适应模型凸显了划痕实验在模拟慢性伤口特征（闭合延迟、炎症信号增强）中的价值，但缺乏免疫细胞相互作用，需结合共培养或3D模型。
**2.3 衰老**
衰老导致细胞增殖功能下降、炎症持续和氧化应激升高。Prakoso等使用7 mM和10 mM甲基乙二醛（MGO）处理成人包皮成纤维细胞（HFF），26小时后伤口面积显著大于对照组（51.33%和53.14% vs 16.16%），表明闭合受损。MGO作为糖酵解副产物通过积累晚期糖基化终末产物（AGEs）和氧化应激破坏细胞功能。Keyes等比较年轻与衰老基底角质形成细胞，发现衰老细胞迁移延迟、间隙闭合缓慢。该模型可用于研究衰老相关缺陷并探索促愈合疗法（如抗氧化剂EGCG）。
**3 优化伤口划痕实验模型的关键因素**
**3.1 影响实验性能的因素**
实验的可重复性和可靠性受细胞类型、培养条件、伤口制造方法及图像获取分析等多个因素影响。
**3.1.1 细胞类型选择**
不同细胞类型在伤口愈合中作用不同：角质形成细胞（HaCaT）负责再上皮化，表现出定向迁移；成纤维细胞（HDF）合成ECM，支持肉芽组织形成和伤口收缩；内皮细胞（HEC/HUVEC）参与血管新生。各细胞固有增殖和迁移速率差异影响闭合动力学，选择合适细胞（或共培养）对获得生物学相关结果至关重要。
**3.1.2 细胞培养条件**
标准化培养条件是减少实验变异的前提，包括血清浓度、葡萄糖水平和生长因子等因素（如高糖模拟糖尿病抑制闭合）。
**3.1.3 血清浓度**
胎牛血清（FBS）或小牛血清（FCS）含多种生长因子（EGF、FGF、TGF-β、VEGF），其存在与否显著影响闭合速率。为独立评估迁移，常降低或去除血清（0%–5%范围），或使用丝裂霉素C（10 μg/mL，2小时）抑制增殖。初步数据显示，低血清条件下EGCG、熊果苷和海藻糖对伤口闭合影响微弱，反映了迁移特异性效应。
**3.1.4 葡萄糖浓度**
生理水平（5.5 mM）通常用于模拟正常体内条件；高糖模型（25–50 mM，甚至150 mM）用于糖尿病研究。浓度选择需依据细胞类型和研究问题（急性或慢性伤口）。
**3.1.5 伤口制造技术**
常见方法包括：移液器吸头（快速但缺口宽度不均、边缘损伤，产生细胞碎片）；细胞刮刀（更均匀但可能机械损伤）；硅胶插入物（减少宽度变异和机械创伤）；自动化工具（如IncuCyte Wound Maker，相对手动方法变异降低>80%，但成本高）。关键参数包括一致的培养条件和可重复的缺口宽度。表1总结了各技术的优缺点：标准手动划痕简单、成本低但变异大；定制伤口工具和自动化系统可重复性高但需专门设备（如Ibidi插入物允许自发迁移，但缺口闭合时间较长）。尽管先进工具提高了可重复性，手动划痕仍凭其多功能性和成本效益被广泛使用。
