基于锁核酸（LNA）的多重RT-qPCR检测方法的开发与验证：用于鉴别欧洲β动脉炎病毒（PRRSV-1）、美洲β动脉炎病毒（PRRSV-2）及PRRSV-2高致病性L8谱系

《The Veterinary Journal》：Development and validation of an LNA-based multiplex RT-qPCR assay for differentiating Betaarterivirus europensis (PRRSV-1), Betaarterivirus americense (PRRSV-2), and the highly pathogenic L8 lineage of PRRSV-2

　　

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）是一种高度变异的动脉炎病毒（arterivirus），可在养猪生产中造成重大经济损失，因此监测和根除项目需要可靠的分子诊断方法。研究人员开发并验证了一种一步法多重逆转录实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测体系，可在单次反应中同步检测并鉴别欧洲β动脉炎病毒（Betaarterivirus europensis，PRRSV-1）、美洲β动脉炎病毒（Betaarterivirus americense，PRRSV-2）以及PRRSV-2高致病性L8谱系，同时纳入RNA内参（internal control, IC）。研究中设计了经锁核酸（locked nucleic acid, LNA）修饰的短探针，以靶向保守但具有鉴别力的序列基序，从而提高特异性并支持多重检测。研究人员采用加标猪血清、天然阳性样本以及独立实验室与商业对照试剂的比较试验，对其分析性能进行了评估。结果显示，该检测体系在所有通道上均具有优异线性关系，R² = 0.99；在95%检出概率下，其检出限较低，为每反应13–26拷贝。稳健性测试表明，室温放置2 h及热循环仪温度偏移3°C仅引起可忽略的Cq变化；而1,000倍竞争模板挑战提示交叉反应极低。体系的批内与批间变异均较低，与商业对照方法的定性一致性达到100%，且试剂在30周内以及最多10次冻融后仍保持稳定。该基于LNA的多重RT-qPCR方法为PRRSV监测与防控项目提供了一种灵敏、特异且操作便利的工具。

该论文发表于《The Veterinary Journal》，聚焦于猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）分子诊断技术的开发与验证。PRRSV是当前全球养猪业最重要的病原体之一，可引发母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率及明显的呼吸系统疾病，并因持续流行和毒株快速演化而给监测、净化和根除工作带来长期压力。现有诊断体系虽然广泛采用RT-qPCR，但PRRSV基因组高度变异，常导致引物和探针设计困难，影响检测的灵敏度、特异性和定量准确性。尤其是在需要同时区分PRRSV-1、PRRSV-2以及特定高致病谱系时，传统依赖简并寡核苷酸的多重检测方案更容易出现非特异扩增、竞争抑制和多重兼容性下降等问题。因此，开展一种兼具高鉴别力、高稳定性和单管多靶标检测能力的新型检测体系研究，具有明确的流行病学和兽医防控意义。

研究人员围绕上述问题，开发了一种一步法四靶标多重RT-qPCR体系，即PRRS-4C qPCR kit。该方法在同一反应中同时检测PRRSV-1、PRRSV-2、PRRSV-2高致病性L8相关标志以及RNA内参（IC），并采用短LNA修饰水解探针提高保守区内微小变异位点的分辨能力。研究结果表明，该体系具备优良的线性、较低的检出限、较强的稳健性、较高的分析特异性、良好的批内和批间重复性，以及与商业试剂相一致的定性诊断能力。研究提示，该方法能够有效应对PRRSV高度异质性的检测挑战，为猪群常规监测、疫情控制及区域或国家层面的净化项目提供技术支撑。

就关键技术方法而言，研究人员首先基于169条PRRSV全基因组序列和646条ORF5编码序列开展序列比对与系统发育背景分析，筛选可用于区分PRRSV-1、PRRSV-2及L8相关标志的靶区。随后设计短LNA修饰探针与多重引物体系，并构建带有异源探针结合区的RNA内参。样本方面使用加标阴性猪血清、29份商业试剂确认的阳性血清、182份阴性血清，以及合作单位提供的L8相关RNA材料；同时采用参考法提取和树脂/热处理快速制样法进行比较。最终通过线性、检出限、稳健性、特异性、重复性、商业试剂比对和稳定性等项目完成系统验证。

在研究结果部分，论文首先报告了“Comparison of RNA purification protocols”。研究人员将RNA Purifier G⁺快速制样方法与Direct-zol?参考提取法进行比较，并指出两者由于下游输入体积不同，理论上应产生ΔCq = log2(200/40) = 2.32个循环的差异。该部分的核心作用在于为后续不同提取方式下的Cq解释提供体积校正背景，而非直接声称某一方法绝对优于另一方法。

在“Linearity”部分，研究人员对PRRSV-2、PRRSV-1和L8-HP-PRRSV分别进行10倍梯度稀释，结果显示各靶标对应荧光通道的线性回归均达到R² = 0.99。扩增效率分别为95.4%（FAM，PRRSV-2）、99.3%（HEX，PRRSV-1）和93.4%（Texas Red，L8-HP-PRRSV）。这一结果说明该多重检测体系在宽动态范围内保持稳定的扩增动力学，适用于定量分析和不同病毒载量样本的检测。

在“Limit of detection (LoD)”部分，研究人员使用低拷贝数加标血清评估检测下限。结果表明，PRRSV-1、PRRSV-2及L8-HP-PRRSV的LoD⁹⁵分别为13.3、17.9和26.4拷贝/反应，LoD⁵⁰分别为3.1、4.2和6.1拷贝/反应。该结果说明此方法在低病毒载量条件下仍保持较高检出能力，其中对PRRSV-1和PRRSV-2的检测灵敏度略优于L8相关靶标，但三者总体均处于较高分析灵敏度水平。

在“Robustness”部分，研究人员模拟了两类常见操作扰动：其一为反应组分室温放置2 h，其二为热循环程序各阶段温度整体上调3°C。通过对5份不同Cq范围血清样本重复检测发现，两种条件下的ΔCq变化均很小，平均分别为+0.46和?0.04，Wilcoxon符号秩精确检验亦未显示显著差异。由此可见，该体系对短时台面暴露及一定程度的仪器温度偏差具有良好耐受性，反映出实际实验环境中的可操作性。

在“Specificity”部分，研究人员采用1,000倍竞争模板挑战评估分析特异性。结果显示，过量PRRSV-2 RNA对PRRSV-1检测几乎无影响，ΔCq仅为+0.20；过量PRRSV-1 RNA对PRRSV-2检测造成轻度延迟，ΔCq为+1.13，但不影响阳性判定；对于L8-HP-PRRSV，L8特异通道ΔCq为?0.08，而PRRSV-2共有区通道为+0.89。该结果说明短LNA探针在多重体系中能够保持较强的错配辨识能力和较低交叉反应风险，尤其支持L8相关标志的特异识别。

在“Intra-assay reproducibility”部分，研究人员使用阴性、弱阳性和明显阳性样本各进行5次重复检测。所有阴性重复均保持阴性；弱阳性样本平均Cq为30.85，标准差（SD）为0.33，变异系数（CV）为1.07%；明显阳性样本平均Cq为26.69，SD为0.24，CV为0.90%。这一结果表明该体系在同批次内具有很高的一致性和精密度。

在“Inter-assay reproducibility”部分，相同三类样本被分装后由5名操作者在10次独立实验中检测。所有阴性样本均持续阴性；弱阳性样本平均Cq为30.57，SD为0.29，CV为0.95%；明显阳性样本平均Cq为27.71，SD为0.60，CV为2.17%。研究结果说明，该检测体系不仅在单次实验内稳定，在不同操作者和不同批次之间也保持了较好的重复性，适合常规诊断场景。

在“Comparison with commercial products”部分，作者分别进行了内部比较和独立实验室评价。内部比较中，20份血清样本采用GalenBio试剂盒与一款可检测三类PRRSV诊断靶标的欧洲商业试剂进行检测，阳性和阴性定性一致率均为100%。15份阳性样本的平均ΔCq为?0.55，提示GalenBio体系平均检出略早。独立实验室评价中，经ISO认证的兽医诊断实验室对不同拷贝水平的PRRSV-1加标血清进行平行比较，平均ΔCq为+0.15。考虑到对照试剂每反应使用了更高的样本输入体积，二者表现仍具有可比性。该部分说明所建方法在外部环境下也具备与商业体系相当的诊断表现。

在“Stability testing”部分，“Long-term storage”结果显示E + P混合液在30周内无明显Cq漂移，回归斜率为每周+0.013 Cq；“Freeze–thaw cycles”结果显示1–10次冻融后平均Cq保持稳定，回归斜率为每次循环?0.0152 Cq。由此可见，该试剂体系具有良好的长期储存稳定性和抗冻融能力，有利于实际生产、运输和实验室使用。

论文讨论部分强调，PRRSV持续进化使常规分子诊断面临持续更新压力，而本研究开发的单管四重LNA探针RT-qPCR体系，针对PRRSV-1、PRRSV-2和L8相关高致病标志提供了兼具灵敏度、特异性和多重兼容性的检测方案。短LNA探针通过增强杂交亲和力和错配识别能力，减少了对简并设计的依赖，同时单管反应也降低了移液误差并有利于高通量应用。作者同时指出，本研究仍存在边界：验证样本尚未经验性覆盖全部PRRSV-2谱系及重组株；Texas Red通道更准确地反映的是Nsp2缺失标志的检出，而非对“高致病性”表型作最终判定；此外，本研究验证主要基于血清和提取RNA，尚未系统覆盖口液等其他样本类型。因此，未来仍需在更广泛地域毒株、更多样本基质和不同仪器平台上持续扩展验证。

研究结论部分可译为：研究人员报道了一种基于LNA的一步法多重RT-qPCR检测体系（PRRS-4C qPCR kit；GalenBio）的开发与验证，该体系可在单次反应中检测并区分PRRSV-1（欧洲β动脉炎病毒）、PRRSV-2（美洲β动脉炎病毒）及L8-HP-PRRSV〔PRRSV-2的L8谱系（lineage L8）〕，并具有较高的分析灵敏度、稳健的特异性和良好的重复性。该方法表现出优异的线性、较低的LoD⁹⁵值、对常见操作波动的耐受性、持久的试剂稳定性，以及与商业对照试剂完全一致的定性结果，尽管在独立评价中其样本输入体积更低。位于保守且具鉴别力位点的短LNA探针增强了特异性，同时支持多重检测。结合整合式RNA内参和快速RNA提取流程，该方法成为适用于常规监测、疫情控制和净化工作的实用工具。未来工作将把验证扩展至更多样本类型、仪器平台和地区，并结合持续的序列监测，随着PRRSV演化主动更新引物和探针设计。