《RSC Chemical Biology》：A fluorescence-activated droplet sorting assay for ultra-high-throughput screening of PET hydrolases based on a pH indicator
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对苯二甲酸乙二醇酯（PET）水解酶的持续发现和工程化对于推进可持续塑料回收至关重要。迄今为止，已鉴定出大量PET水解酶；然而，高通量筛选和酶特性评估仍然是蛋白质工程中的关键瓶颈。本研究开发了一种基于pH感应的超高通量荧光激活液滴分选（FADS）系统，用于筛选P
对苯二甲酸乙二醇酯（PET）水解酶的持续发现和工程化对于推进可持续塑料回收至关重要。迄今为止，已鉴定出大量PET水解酶；然而，高通量筛选和酶特性评估仍然是蛋白质工程中的关键瓶颈。本研究开发了一种基于pH感应的超高通量荧光激活液滴分选（FADS）系统，用于筛选PET水解酶。由解聚产物对苯二甲酸（TPA）释放引起的pH变化与pH敏感探针C-SNARF-4F的荧光变化相关联。研究人员应用该方法筛选了两种PET水解酶（DepoPETase β和一种通过基因组挖掘鉴定的新酶SdPETase（来源于Saccharopolyspora dendranthemae））的突变文库。成功获得了对于DepoPETase β和SdPETase分别具有1.21倍和2.65倍更高水解活性的变体。基于pH的测定与FADS的成功整合突显了其在PET水解酶超高通量筛选中的多功能性和效率。
塑料污染是全球性环境挑战，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）作为广泛生产的塑料之一，其酶法降解因条件温和、能保留单体质量而受到关注。然而，天然PET水解酶（PET hydrolases）存在催化效率低、热稳定性差、对高底物负载耐受性不足以及产物抑制等问题，难以直接工业应用。因此，通过定向进化（directed evolution）和理性设计（rational design）优化酶性能成为关键，但高通量筛选（high-throughput screening）技术仍是主要瓶颈。传统方法如微量滴定板显色法通量有限，无法满足大规模突变库的评估需求。为突破这一限制，研究人员将pH指示剂与荧光激活液滴分选（FADS）系统结合，开发了超高通量筛选平台，用于PET水解酶的工程化改造。
本研究构建了基于pH响应的FADS系统，利用BHET（bis(2-hydroxyethyl)terephthalate）作为模型底物，C-SNARF-4F荧光pH探针检测酶解产生的酸性产物（如TPA）导致的pH下降。该系统通过微流控芯片实现单细胞封装、底物微量注射、激光激发荧光检测及介电泳分选，筛选通量达0.5–2 kHz。研究人员首先验证了方法的可行性：以1:9比例混合含DepoPETase β和空载体的预混库，分选后78.1%的回收群体表现出水解活性。随后，对DepoPETase β进行易错PCR（epPCR）突变库筛选，约15000个变体经一次筛选后获得6个候选，其中S92G变体活性提高1.21倍。进一步，基于序列相似性网络（SSN）和系统发育分析，从数据库挖掘到7个候选PET水解酶，其中SdPETase（源自Saccharopolyspora dendranthemae）显示出最高BHET水解活性，被选为定向进化模板。对SdPETase进行两轮易错PCR筛选（约18000个克隆），获得最佳变体M2（K175S/T194P/T195R），其活性较野生型（WT）提高2.62倍，但在60°C下因热稳定性下降（Tm从73.55°C降至68.62°C）而活性降低。该研究证明了pH基FADS系统在PET水解酶超高通量筛选中的高效性与通用性，相关成果发表在《RSC Chemical Biology》。
**主要关键技术方法**
研究采用的核心技术包括：微流控液滴分选系统（fluorescence-activated droplet sorting, FADS），通过微芯片实现单细胞封装、底物电针注入（picoinjection）及介电泳分选；pH敏感荧光探针C-SNARF-4F，用于实时检测液滴内pH变化；以BHET（10 mM）为模型底物，其水解产物TPA引发pH下降，经488 nm激光激发后检测590 nm和660 nm的双波长荧光比值。此外，通过基因组挖掘（genome mining）从NCBI和UniProtKB数据库获取314个同源序列，经序列相似性网络和系统发育分析筛选候选酶。
**研究结果**
**1. 微流控液滴基超高通量筛选方法的开发**
通过构建FADS系统（含单细胞封装、底物注射和分选芯片），实现了每分钟数千液滴的实时荧光检测。C-SNARF-4F在pH 4.6–9.0范围内呈现双波长发射（590 nm和660 nm），质子化形式增强590 nm荧光。采用预混库验证（DepoPETase β与空载体1:9），分选后78.1%的回收群体具有活性，证明系统可有效富集活性变体。
**2. 使用FADS筛选DepoPETase β随机突变库**
对DepoPETase β进行易错PCR，构建约15000个变体的库。经pH基FADS分选、二次筛选及PET膜活性验证，获得4个活性提升12%–21%的变体，最佳变体S92G活性提高1.21倍。其中部分突变位点（213、212、224、119）已有文献报道，证实筛选策略的有效性。
**3. 新PET水解酶的鉴定与表征**
以LCC为模板，通过序列相似性网络从数据库筛选出7个候选酶，经异源表达和pH活性检测，其中5个（HxPETase、SdPETase、CaPETase、RsRPETase、SsHPETase）显示可检测PET水解活性。SdPETase对BHET活性最高，被选为后续工程化对象。
**4. 使用基于pH的FADS筛选SdPETase随机突变库**
对SdPETase进行两轮易错PCR筛选（共约18000个克隆）。第一轮获得双突变T194P/T195R（M1），活性提高1.58倍；第二轮以M1为模板获得K175S和A222S，重组变体M2（K175S/T194P/T195R）活性较WT提高2.62倍。纯化后的M2在50°C下处理PET粉末，8 h和24 h的水解产物浓度分别为1.60 mM和2.99 mM，是WT的1.66倍和2.65倍。但60°C时M2因Tm降低4.93°C而活性下降。
**结论与讨论**
本研究表明，将pH响应荧光测定与FADS系统结合，可实现PET水解酶的超高通量筛选。该平台具有敏感pH检测、与胞外分泌酶兼容、实时评价等优势，成功用于两种PET水解酶的定向进化，获得活性提升的变体。尽管对DepoPETase β的改进幅度有限，但对SdPETase的两轮进化使最佳变体M2活性提高2.65倍。该技术为工业相关PET降解酶的工程化提供了高效筛选工具。
