《Frontiers in Neuroscience》：Spatial transcriptomics on an expanded dataset at the brain-electrode interface: exploration of variability and identification of novel biomarkers
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对植入脑内电极的异物反应（FBR）长期被认为是影响留置神经技术性能和可靠性的主要挑战。空间分辨转录组学方法能够对设备-组织界面的细胞和分子动态进行高分辨率绘图，为急性和慢性组织反应提供了新的见解。近期全转录组分析方法从单个样本生成异常密集的基因表达数据集，提供
对植入脑内电极的异物反应（FBR）长期被认为是影响留置神经技术性能和可靠性的主要挑战。空间分辨转录组学方法能够对设备-组织界面的细胞和分子动态进行高分辨率绘图，为急性和慢性组织反应提供了新的见解。近期全转录组分析方法从单个样本生成异常密集的基因表达数据集，提供了前所未有的分辨率和分析能力。然而，由于高昂的成本和复杂的下游分析，目前很少有研究利用这些技术探索较大数据集的汇总结果以及植入队列中样本间变异。在这项工作中，研究人员对从扩大队列（n = 14只大鼠）中收集的空间转录组学数据进行了全面报告，这些大鼠在运动皮层内植入了硅基微电极阵列，持续时间为1周（急性）和6周（慢性）。该较大数据集使研究人员能够探索跨样本结果变异、评估离群值并检查潜在批次效应。研究人员采用差异表达分析（DEA）鉴定设备-组织界面空间定义区域中的顶部差异表达基因（DEGs），以揭示汇总数据集中的新生物标志物。研究人员评估了样本间变异，并应用因子分解策略识别顶部DEGs的突出细胞类型贡献者。基于网络的共表达分析揭示了控制设备-组织界面的基因模块、核心基因（hub genes）和核心调控过程。研究结果表明：(a) 在1周时间点，顶部DEGs跨样本变异较大，且以小胶质细胞和星形胶质细胞贡献者为主；(b) 在6周时间点，顶部DEGs跨样本变异较小，并转向以星形胶质细胞贡献者为主；(c) 新生物标志物提示在1周时间点存在巨噬细胞和小胶质细胞介导的过程及稳态事件，而在6周时间点则存在更强的组织重塑、凋亡和突触变化。这些发现支持了先前关于植入设备组织反应演变的观点，并在生物标志物、生物学过程和样本变异方面提供了新细节。此外，本研究为评估采用高维空间转录组学的较大数据集提供了框架，并强调了与跨样本变异和批次效应相关的关键考量。
### 研究背景、问题与研究意义
植入脑内的电极装置（如脑机接口和神经调控系统）在神经功能研究及神经系统疾病治疗中具有革命性意义，但长期存在信号衰减和性能不稳定问题。这种不稳定性主要源于植入电极引发的异物反应（FBR），包括插入创伤、慢性炎症及组织重塑等。传统组织学方法（如评估神经细胞密度和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达）通量较低，难以全面揭示界面处的复杂生物学机制。近年高通量RNA测序和空间转录组学（ST）技术实现了对设备-组织界面分子动态的高分辨率绘图，然而其高昂成本限制了样本量，导致跨样本变异性和批次效应等关键问题尚未充分探索。为此，研究人员通过扩大样本队列（n=14只大鼠），对植入硅基微电极阵列（motor cortex）后1周（急性期）和6周（慢性期）的空间转录组学数据进行系统分析，旨在揭示跨样本变异、鉴定新生物标志物并阐明FBR的时空动态。该研究发表于《Frontiers in Neuroscience》。
### 主要关键技术方法
1. **空间转录组学（ST）与免疫组化（IHC）联合**：使用10x Genomics Visium平台，对组织切片进行GFAP和NeuN免疫荧光染色，结合空间条形码寡核苷酸捕获mRNA，获取全转录组空间表达图谱。
2. **差异表达分析（DEA）**：通过Loupe Browser软件手动选择“近”（<200 μm）和“远”（~500 μm）区域，比较基因表达的Log2倍数变化（LFC）及调整后p值，鉴定差异表达基因（DEGs）。
3. **非负矩阵分解（NMF）**：基于先前报道方法，将归一化空间转录组数据分解为细胞类型丰度图，通过Pearson相关系数和余弦相似度推断DEGs的主要细胞类型贡献者（如星形胶质细胞、小胶质细胞等）。
4. **DiffCoRank差异共表达网络分析**：通过UMAP和DBSCAN聚类识别基因模块，基于度、紧密度、介数和特征向量中心性鉴定核心基因（hub genes），探索近与远区域基因共表达模式变化。
样本队列来源：成年雄性Sprague Dawley大鼠（约12周龄），n=14只（1周组7只，6周组7只），植入单柄平面硅基微电极阵列。
### 研究结果
**3.1 1周与6周植入物间及内部的差异表达基因（DEGs）**
通过比较1周与6周近植入区域（<200 μm）的DEGs，鉴定出16个显著差异基因（padj<0.05）。例如，Hmox1和S100a9在1周显著上调，反映急性期小胶质细胞/巨噬细胞主导的炎症反应；而Ctsk和Ighm下调，提示早期细胞代谢和免疫应答变化。此外，1周近与远区域比较发现63个DEGs，包括Spp1、Lgals3、C3等，凸显趋化因子（Cxcl3、Cxcl2、Ccl2）和细胞因子（Il1b）介导的神经炎症；6周近与远区域比较发现57个DEGs，其中A2m和Calb1的显著上调提示慢性期神经退行性改变，而Gfap高表达证实胶质包裹。
**3.2 近植入区域顶部DEGs的跨样本变异**
通过计算中位数归一化平均值（MNA）及方差，发现1周样本中DEGs（如Cxcl3、Spp1、Il1b）的样本间变异显著高于6周，表明急性期FBR更具异质性。部分基因（如Gfap、Lyz2）在6周仍维持较高变异，而少数基因（如Cyba、Cfh）在两时间点均表现低变异。特定单样本驱动了部分基因的高变异，提示植入损伤或个体差异可加剧FBR。
**3.3 非负矩阵分解（NMF）鉴定细胞类型贡献者**
NMF分析显示，1周时顶部DEGs主要以小胶质细胞和星形胶质细胞为贡献者，其中约40%样本中小胶质细胞贡献更强（如Cxcl3、Hmox1）；6周时星形胶质细胞贡献更一致（如A2M、S100a4），并出现与神经元和少突胶质细胞的负相关（如Spp1、Il1b），表明慢性期胶质反应对神经元和支持细胞的负面影响。
**3.4 DiffCoRank识别核心基因与差异共表达模块**
通过DiffCoRank分析三个比较条件，获得基因模块和核心基因：
- (1) 近植入区域1周 vs 6周：核心基因为Kif5a（神经元健康与轴突转运）、Rabac1（囊泡运输）和Dnm1l（线粒体分裂），强调神经损伤修复和能量代谢过程。
- (2) 1周近 vs 远区域：核心基因为Mif（炎症介质）、Rpl18（神经发育）和B3galt4（神经节苷脂合成），突出急性期细胞因子/趋化因子信号和应激反应。
- (3) 6周近 vs 远区域：核心基因为Hspd1（HSP60，免疫激活）、Fam171b（神经退行性变）和Tmem132a（Wnt信号调控），主要涉及组织重塑、凋亡和突触功能。
### 讨论与结论
讨论部分总结了本研究的主要贡献：扩大样本量使研究人员能探索跨样本变异性和批次效应，并结合NMF和DiffCoRank方法深入揭示细胞贡献者和调控网络。研究表明，植入电极后的急性期（1周）FBR呈现高度异质性的小胶质细胞和星形胶质细胞反应，以巨噬细胞/小胶质细胞介导的趋化因子/细胞因子信号为主；慢性期（6周）则趋于稳定，星形胶质细胞贡献增强，伴随神经退行性标志物（如A2m、Calb1）上调及凋亡、组织重塑相关基因网络的紧密连接。这些结果支持了FBR从急性到慢性的演变过程，并提供了新生物标志物（如Spp1、Hmox1、A2M等）用于评估生物相容性。此外，研究指出了批次效应和样本变异对分析的潜在影响，Visium平台虽能全转录组绘图，但其超细胞分辨率（55 μm直径斑点）可能遗漏稀有细胞群和低表达转录本，未来可通过单细胞测序验证细胞贡献者。
**结论**：本研究分析了植入脑电极界面的大规模空间转录组数据集（n=14只大鼠），通过差异表达分析、样本间变异评估、NMF细胞类型推断及DiffCoRank网络分析，证实了已知的炎症反应特征，并发现了新的生物标志物和调控过程。结果表明，急性期（1周）FBR由多样的小胶质细胞和星形胶质细胞驱动，以巨噬细胞/小胶质细胞介导的趋化因子/细胞因子信号为主；慢性期（6周）则变异减小，星形胶质细胞贡献更协调，伴随神经退行性变和癌症相关标志物上调，以及涉及组织重塑、凋亡和突触功能的紧密基因网络。研究为理解设备-组织界面细胞和分子动态提供了新见解，并强调了跨样本变异性和批次效应在分析中的重要性。
