《Sensory Neuroscience》：Local and Non-Local Sensitization Following Repetitive von Frey Filament Testing in Unoperated Sprague-Dawley and Lewis Rats
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足底及背侧von Frey（VF）纤维丝测定法广泛用于评估外周神经损伤、脊髓损伤及镇痛干预后啮齿动物的机械伤害性感受，但重复测试对缩足阈值及潜在敏化（sensitization）的影响尚未明确。本研究对未手术雄性及雌性Lewis和Sprague-Dawley（
足底及背侧von Frey（VF）纤维丝测定法广泛用于评估外周神经损伤、脊髓损伤及镇痛干预后啮齿动物的机械伤害性感受，但重复测试对缩足阈值及潜在敏化（sensitization）的影响尚未明确。本研究对未手术雄性及雌性Lewis和Sprague-Dawley（SD）大鼠实施不同重复频率的足底与背侧VF检测——每日1～15天、日间不同休息间隔、低重复（每日1～2次）与高重复（每日8次，小时间隔）方案。足底VF检测于胫神经（tibial nerve）支配的中足底区域每日8次（组#1）；背侧VF纤维丝施于腓肠（sural）与隐神经（saphenous）支配区，分四方案：组#2双侧sural区每日8次；组#3双侧sural及saphenous区每日1次；组#4双侧上述两区每日2次；组#5左侧sural区每日8次、其余区每日2次以检测非局部效应。低重复背侧VF测试（组#3、#4）未诱发敏化；高重复足底（组#1）与背侧VF测试（组#2、#5）均产生显著局部敏化且随连续测试日增强；组#5在微测区域亦出现非局部敏化。高重复背侧VF测试（组#2、#5）后经休息可恢复，足底VF测试（组#1）则不能。动物因重复操作及测试产生的躁动不影响结果。平均VF缩足阈值或敏化无显著性别（组#1、#2、#5）或品系差异（组#2、#5）。综上，高重复VF测试可致敏化，应视为方法学变量。
研究背景与目的
von Frey（VF）纤维丝测定法是啮齿类动物皮肤机械伤害性感受（mechanical nociception）最广泛使用的检测手段之一，常用于外周神经损伤、脊髓损伤及镇痛药效评价中量化机械性异常性疼痛（allodynia）与痛觉过敏（hyperalgesia）。现有研究多采用每日一次或每周一次的低频测试方案，但在药效学时间进程或镇痛药物药代动力学研究中，常需同一日内多次、高频采样。理论上高频重复机械刺激可能引致伤害性通路敏化（sensitization）或习惯化（habituation），从而掩盖药物效应或错误解读感觉功能变化。然而截至目前尚无同行评议研究系统考察重复VF测试本身——而非组织损伤——对缩足阈值及局部与非局部敏化的影响，也未知动物因反复抓取、束缚产生的躁动行为是否会混淆阈值变化。为此，研究人员在未手术雄性/雌性Sprague-Dawley（SD）与Lewis大鼠上设立五组不同VF测试频率与部位的方案，系统检验假设：高重复（而非低重复）VF测试会诱发局部及非局部敏化，背侧与足底VF测试的敏化后恢复特征不同，且阈值变化非由动物躁动所致。本文发表于《Sensory Neuroscience》。
主要关键技术方法
研究人员使用未手术雄性SD、雌性SD及雌性Lewis大鼠（n＝34，无跨组复用），适应性驯化3天后按五组方案测试：组#1（n＝10，♂♀ SD）足底胫神经支配中足底区每日8次/h间隔；组#2（n＝6，♀ Lewis）背侧双侧sural区（M4?5）每日8次/h；组#3（n＝6，♂ SD）背侧sural＋saphenous（M1?2）区每日1次；组#4（n＝6，♂ SD）背侧上述两区每日2次（ZT3、ZT10）；组#5（n＝6，♂ SD）左侧sural区每日8次/h，余区每日2次。足底采用简化up?down VF法，背侧采用改良背侧VF法（毛巾包裹短暂固定），使用Touch Test Sensory Evaluator套件行up?down序列测定缩足阈值，力值按公式Force＝100.904×(Filament #)?3.54换算为克。记录动物躁动（Normal/Restless）二分类评分。数据统计采用单因素/双因素重复测量（RM）ANOVA、混合效应模型、Dunnett多重比较、配对t检验及Welch t检验（GraphPad Prism 10）。
研究结果
3.1 Repetition?Dependent Local Sensitization（Group #1 and Group #2）
组#1每小时足底测试致第1天起缩足阈值由77.5±8.4 g降至27.2±6.1 g（p＝0.00013），连续3日累积敏化最低至13.5±3.4 g；组#2每小时背侧sural测试致第1天阈值由50.5±5.2 g降至23.4±3.3 g（p＝0.000004），第3天最低至13.6±1.5 g。左右肢无差异合并分析。结论：高频足底与背侧VF均可诱发显著的同日局部敏化且逐日累积。
3.2 Dorsal Recovery Toward Baseline Withdrawal Thresholds Following Longer Recovery Intervals
组#1足底敏化经1天或9天休息间隔均未恢复（p＞0.05各配对t检验），第15天起始阈值仍显著低于Day1基线（F(5,45)＝12.03，p＝2.0×10?7）。组#2背侧敏化经Day4休息（即Day3→Day5 ZT3）阈值由13.6±1.5 g升至27.9±3.2 g（p＝0.00043）但仍低于Day1基线（p＝0.0071）；经Day7–14九天休息后进一步回升至38.4±0.0 g（p＝0.0388），重测当日再出现敏化降至16.6±3.3 g（p＝4.4×10?5）。结论：背侧高频测试诱导敏化可经≥1天部分恢复、≥9天接近恢复，足底敏化则不恢复。
3.3 Baseline Comparisons
Day1 Hour1阈值与已发表基线无差异（p＝0.1451），Day3 Hour8显著低于自身基线及文献基线（p＝0.0041），验证重复刺激致敏化而非批次差异。
3.4 Once and Twice?Daily von Frey Testing（Group #3 and Group #4；♂ SD）
组#3每日1次、组#4每日2次（间隔约8 h）背侧sural与saphenous区测试，各时间点相对Day1基线均无显著差异（所有校正p＞0.05），同日ZT3与ZT10亦无差异。结论：低频（≤2次/日）背侧VF测试不引起敏化，阈值稳定跨14天。
3.5 Sensitization and Recovery From Sensitization Are Local and Non?Local Following Repeated Dorsal VF Testing（Group #5；♂ SD）
组#5中高频测试左sural区（每小时）及微测其他三区（每日2次）。四区均以Day1 ZT3为基线出现同日阈值显著下降（左sural p＝0.0042；右sural p＝0.0131；左saphenous p＝0.0116；右saphenous p＝0.0142，单因素RM ANOVA），微测区阈值绝对值高于高频区但仍有统计学敏化。结论：重复背侧VF测试不仅致高频刺激局部敏化，还引致同侧邻区、对侧同/异神经支配区的非局部（non?local）敏化，提示中枢或广泛性感觉可塑性参与。
3.6 No Sex/Strain Differences
组#1雌雄SD及各时间点阈值无性别差异（p＝0.57，Welch t检验）；组#2（♀ Lewis）与组#5（♂ SD）时间主效应显著但组别主效应（p＝0.20）及时间×组别交互（p＝0.053）不显著。结论：本研究观测的VF基线及重复测试敏化模式无显著性别或品系差异。
3.7 Rat Restlessness Does Not Affect VF Withdrawal Thresholds
按Normal/Restless分类混合效应分析示两类动物各时间点阈值无差异（p＞0.05），躁动比例跨日无显著趋势（χ2＝0.1755，p＞0.05）。结论：所记录躁动行为不驱动阈值降低，敏化为真感觉改变。
讨论与结论翻译
研究人员发现高频（每日8次/h间隔）足底及背侧VF测试均可诱导局部敏化——足底敏化持续不恢复，而背侧敏化经1天部分恢复、约9天基本恢复，且背侧高频单点刺激还可引发非局部敏化波及微测区。低频（每日1～2次）背侧VF测试不引起敏化且阈值稳定。无性别或品系差异，动物躁动不混淆结果。VF测试频率与部位应作为方法学变量纳入实验设计考量。
Conclusion（结论原文意译）
本研究表明VF测定在不同测试方案下并不产生等同结果。采用低重复频率（每日1或2次）时，大鼠背侧伤害性缩足阈值在测试日内及连续多日间保持稳定；而高重复测试（如一日多次）可使VF测试本身降低痛阈——不仅在被频繁刺激区域，也出现在远隔区域。通过量化这些变化并确定阈值恢复正常所需时间，本研究为未来研究提供实用注意事项与指导建议。
