自然杀伤细胞能治愈白血病吗？

《Leukemia》：Can natural killer cells cure leukemia?

　　

截至2025年，包括大型制药公司在内的140家公司正在开发160种自然杀伤细胞（NK细胞）策略，涵盖NK细胞产品（主要为异基因）、NK细胞衔接器以及细胞因子或其他蛋白以更充分释放NK细胞功能。扎实的基础与临床研究表明，NK细胞输注具有强大的抗肿瘤活性，且无疑比T细胞更安全，不会引发移植物抗宿主病（GVHD）或细胞因子释放综合征（CRS），但仍存在未完全克服的局限性，难以维持行业投资以实现商业化（图1）。临床前景得到了许多小型学术机构临床试验甚至部分工业界试验的支持[1]，其中许多试验聚焦于治疗血液系统恶性肿瘤。尽管并非全部已发表，但研究人员估计，过去20年间全球已有数千名癌症患者接受了基于NK细胞的策略治疗多种癌症。图1：NK细胞与T细胞疗法的优势与挑战比较。NK细胞疗法的主要优势包括安全性更高、GVHD风险降低以及可制备异基因或通用供体用于即用型使用。当前NK细胞疗法的主要局限性集中于其受限的抗原特异性增殖能力、有限的体内持久性以及针对急性髓系白血病（AML）不完整的记忆样反应。研究人员20年前发表了首个未经基因编辑的单供体来源半相合NK细胞试验，结果在复发/难治性（r/r）急性髓系白血病（AML）患者中实现了高达50%的完全缓解（CR）[2,3,4]。这些发现已由其他研究小组通过脐带血[5]、外周血[6,7]、胎盘（NCT02781467）以及可再生诱导多能干细胞（图2）[1]扩增的NK细胞所验证。在最初用IL-2或IL-15进行简单过夜激活后，研究人员开发了额外策略以生成细胞因子诱导记忆样（CIML）NK细胞，在r/r AML中实现了44%的CR率[7]。使用工程化饲养细胞扩增NK细胞以支持更大剂量多次给药策略，在r/r AML中实现了58%的CR率[8]。当将来自同一供体的NK细胞用于同种异体移植时，即NK细胞对重建免疫系统为自体情况下，NK细胞可持久存在并避免快速同种异体排斥[9]。尽管前景可期，但迄今的临床经验使研究人员得出结论：为实现持久疗效并获得商业批准，NK细胞疗法需要抗原驱动增殖、长期持久性和功能性记忆（图1）。图2：图示克服当前白血病NK细胞疗法局限性的有前景方法。左侧：可用于过继性细胞疗法的3种NK细胞主要来源（CMV+供体外周血、脐带血和诱导多能干细胞）。中间和右侧：5种增强NK细胞抗白血病疗效的方法，包括：(1) 使用CMV+供体“ADAPT-NK”细胞，其表达高水平NKG2C并筛选患者错配的KIR表达；(2) 靶向肿瘤抗原如CD33、CD123或CLEC12A的嵌合抗原受体（CAR）构建体；(3) 通过CD16和IL-15受体复合物向NK细胞提供信号并引导NK细胞杀伤肿瘤抗原的三特异性杀伤衔接器（TriKE）分子；(4) 通过IL-12、IL-15和IL-18对离体NK细胞进行细胞因子诱导记忆样（CIML）激活；(5) 敲除CD38基因。从慢性淋巴细胞白血病（CLL）中靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）T细胞（CTL019）临床试验中学习[10,11]，在这些试验完成后进行了一项信息量丰富的回顾性研究，以确定应答和耐药的决定因素。应答与患者年龄、外周肿瘤负荷、既往治疗或其他常见因素无关。实现CR的患者在输注后最初两周内表现出CTL019细胞显著的体内扩增，同时伴有B细胞再生障碍。相比之下，无应答（NR）患者表现出有限的或大多数情况下无体内T细胞增殖，且B细胞再生障碍程度远低。在延长随访分析中，观察到超过5年的CR，这些患者外周血中仍可检测到CTL019细胞并伴有持续性B细胞再生障碍。除扩增和持久性外，CR患者在白细胞分离时CD45RO^-CD27⁺CD8⁺T细胞的频率显著高于PR/NR患者[12]。CD8⁺T细胞的CD45RO^-CD27⁺亚群处于静息状态并具有长寿命记忆细胞的特性[13]。因此，长期缓解与初始富集长寿命记忆细胞、显著体内扩增和功能性持久性相关[12]。类比而言，研究人员认为这些相同原则是解锁NK细胞免疫治疗变革性进展的关键。NK细胞是CD8⁺T细胞的近亲，通过种系编码的激活受体介导对恶性细胞的直接细胞溶解[14]。作为先天免疫系统成员，大多数NK细胞与CD8⁺T细胞有两个关键区别：它们在激活后不会发生快速克隆扩增，也不会长期持久存在。缺乏适应性免疫的定义性特征很可能是接受NK细胞免疫疗法治疗r/r疾病的患者普遍缺乏长期缓解的原因。为使NK细胞在免疫治疗领域与T细胞匹敌，它们需要表现出抗原驱动扩增并作为功能性记忆库长期持久存在（图1）。换言之，NK细胞必须能够像T细胞一样行动。幸运的是，人类NK细胞具有显著多样性[15]，并且至少在一个情境下NK细胞记忆会形成。在小鼠和人类中，巨细胞病毒（CMV）感染可导致抗原特异性NK细胞发生稳健的克隆扩增，这些细胞保持自然细胞毒性并以稳定频率持续数月甚至数年[16,17,18,19,20]。表现出淋巴细胞记忆这些标志性特征的NK细胞通常被称为“适应性”NK细胞。有趣的是，适应性NK细胞和效应CD8⁺T细胞共享重叠的全基因组表观遗传图谱[17]，提示适应性NK细胞存在独特的发育路径。晚期血液系统恶性肿瘤患者在接受减强度造血细胞移植后CMV再激活与适应性NK细胞显著扩增和更好的无病生存期相关，这归因于对复发的保护[18,21]。过继性转移离体扩增的适应性NK细胞是一种具有直接转化潜力的有前景方法。CMV血清阳性“超级供体”携带大量表达NKG2C⁺的适应性NK细胞亚群，具有单自体KIR表达。这些NK细胞被称为“ADAPT-NK细胞”，可通过工程化饲养细胞离体扩增高达1000倍，并在体内表现出针对肿瘤细胞系的高效同种异体反应性（图2）[22]。ADAPT-NK细胞的制备流程已在GMP条件下放大，计划在研究人员所在机构及卡罗林斯卡研究所开展针对r/r急性髓系白血病患者的临床试验。HLA-C1/C1或HLA-C2/C2纯合患者将接受具有单自体KIR且与HLA-C错配的ADAPT-NK细胞输注。值得注意的是，ADAPT-NK细胞仍高表达CD16及其共刺激受体CD2，这为未来利用现有治疗性单克隆抗体或研究人员团队开发的三特异性杀伤衔接器（TriKE）分子（图2）[23,24]增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）以提升自然细胞毒性提供了转化契机。这些衔接器激动性结合NK细胞上的CD16以及AML原始细胞上的CD33或CLEC12A，同时将IL-15递送至免疫突触。该方法可允许内源性NK细胞在体内变为抗原特异性，或与NK细胞输注产品联合使用，如CD30 NK细胞衔接器联合异基因NK细胞治疗霍奇金病的报道[25]。研究人员团队长期致力于生成具有免疫记忆特性的诱导多能干细胞（iPSC）来源的NK细胞（称为“iNK”）。iNK细胞平台相比传统细胞免疫治疗产品具有多项重要优势，包括可再生细胞来源、高效多重基因编辑能力以及单次生产运行即可产生数十亿细胞用于即用型使用（图2）[26]。近期，研究人员发现适应性NK细胞与其经典对应细胞在CD38表达上存在差异，CD38是一种具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）糖苷水解酶活性的外肽酶[27]。适应性NK细胞表面CD38低表达或不表达与细胞内NAD⁺浓度升高（相比经典NK细胞）以及对氧化应激诱导的细胞死亡具有抵抗性相关。CRISPR介导的iNK细胞CD38敲除支持了这些发现，CD38敲除iNK细胞表现出细胞内NAD⁺水平升高、对氧化应激显著抵抗以及广泛的基因表达变化，与适应性NK细胞的转录谱相似[28]。研究人员认为，NK细胞免疫疗法治疗多种类型癌症可能达到或超过CAR T细胞的效果，且安全性更优、成本更低。尽管上述研究朝着正确方向迈出了步伐，但仍需更深入理解适应性NK细胞的个体发育及其实现抗原诱导克隆扩增和长期持久性的机制基础，以开发可实现完全且持久缓解的新型基于NK细胞的免疫疗法。具有免疫记忆特性的下一代iNK细胞可通过整合CAR进一步工程化，用于预防同种异体排斥和实现抗原特异性效应功能。研究人员团队目前正在开发针对NK细胞优化高表达和功能的新型CAR策略，新开发的CAR iNK细胞产品可与TriKE联合使用以增强效力。一项关于抗CD16/IL-15/抗CD33 TriKE治疗r/r AML成人患者的I期剂量探索试验目前正在明尼苏达大学招募患者（NCT06594445）。总之，过去十年NK细胞免疫疗法取得了显著进展，得益于工业界与学术界的合作，许多突破从实验室走向临床。整体而言，这些工作为未来十年的持续进步奠定了基础。前方仍面临重大挑战，但研究人员从CAR T细胞经验中已了解定义临床成功与失败的参数。成功的关键在于抗原驱动增殖、长期持久性和功能性记忆。随着NK细胞免疫治疗领域未来发展，研究人员应牢记这一点。

**研究背景与问题**
白血病作为一种血液系统恶性肿瘤，传统治疗手段（如化疗、移植）存在复发率高、毒副作用大等局限。近年来，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中取得显著疗效，但伴随细胞因子释放综合征（CRS）和移植物抗宿主病（GVHD）等严重安全性问题。自然杀伤细胞（NK细胞）作为先天免疫系统的成员，具有无需预致敏即可直接杀伤肿瘤细胞、不引起GVHD的优点，成为新兴的免疫治疗候选手段。然而，NK细胞在体内扩增能力有限、持久性差且缺乏长效记忆功能，导致针对复发/难治性急性髓系白血病（r/r AML）的临床缓解率虽可达50%左右，但持久性不足，难以实现商业化成功。因此，如何赋予NK细胞类似T细胞的抗原驱动扩增、长期存续和功能性记忆特性，是当前研究的核心挑战。
**研究目的**
本文发表于《Leukemia》，旨在总结NK细胞治疗白血病的现况、局限性及突破性进展，提出通过适应性NK细胞、诱导多能干细胞（iPSC）来源的NK细胞（iNK）以及基因编辑等策略来克服上述瓶颈，并类比CAR T细胞的关键成功参数（抗原驱动增殖、长期持久性、功能性记忆），指出NK细胞疗法未来发展的方向。
**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术：1) 离体扩增技术：利用工程化饲养细胞（例如表达膜结合IL-21的K562细胞）从巨细胞病毒（CMV）血清阳性供体的外周血、脐带血或iPSC中扩增适应性NK细胞（ADAPT-NK），实现高达1000倍的扩增；2) 基因编辑技术：通过CRISPR/Cas9敲除iNK细胞中的CD38基因，以增强其对氧化应激的抵抗力和记忆样特性；3) 三特异性杀伤衔接器（TriKE）分子：构建抗CD16/IL-15/抗CD33或抗CLEC12A的双特异性/三特异性抗体，同时激活NK细胞并靶向AML原始细胞；4) 细胞因子诱导记忆样（CIML）激活：使用IL-12、IL-15、IL-18预激活NK细胞，使其获得记忆样表型；5) 嵌合抗原受体（CAR）技术：开发针对NK细胞优化的CAR构建体，靶向CD33、CD123、CLEC12A等抗原。样本队列来源包括CMV血清阳性供体的外周血、脐带血以及诱导多能干细胞系。
**研究结果**
**1. 复制T细胞成功参数：抗原驱动增殖、长期持久性与功能性记忆**
通过回顾CD19 CAR T细胞（CTL019）治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）的临床试验，发现实现完全缓解（CR）的患者在输注后两周内表现出显著的体内扩增和持续的B细胞再生障碍，且初始CD45RO^-CD27⁺CD8⁺T细胞频率更高，提示这些长寿命记忆细胞是成功的关键。类比而言，NK细胞若能达到抗原驱动扩增、长期存续和记忆功能，则有望实现持久缓解。
**2. 适应性NK细胞的发现与应用**
CMV感染后可诱导NK细胞发生抗原特异性克隆扩增，这些适应性NK细胞（NKG2C⁺、单自体KIR表达）与效应CD8⁺T细胞共享表观遗传特征，且与造血干细胞移植后更好的无病生存期相关。通过工程化饲养细胞将CMV血清阳性“超级供体”的ADAPT-NK细胞离体扩增1000倍，并保持高表达CD16和CD2，可用于HLA-C错配的AML患者输注，同时可与治疗性抗体或TriKE联合增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。
**3. iPSC来源的NK细胞（iNK）的工程化改造**
iNK平台具备可再生、易多重编辑、可大规模生产等优势。研究发现适应性NK细胞表面CD38低表达，与细胞内NAD⁺水平升高和抗氧化应激能力相关。CRISPR敲除iNK细胞的CD38基因后，iNK细胞表现出类似适应性NK细胞的NAD⁺升高、氧化应激抵抗和转录谱变化，为工程化产生记忆样iNK细胞提供了新思路。
**4. 三特异性杀伤衔接器（TriKE）的临床转化**
抗CD16/IL-15/抗CD33 TriKE分子可同时结合NK细胞的CD16、提供IL-15信号并靶向AML的CD33抗原，增强NK细胞的特异性杀伤功能。该TriKE的I期剂量探索试验（NCT06594445）正在明尼苏达大学招募r/r AML患者。
**讨论与总结**
**讨论部分**：研究人员指出，尽管NK细胞疗法在安全性上优于T细胞，但缺乏抗原驱动扩增和长期记忆是其尚未超越CAR T细胞的关键原因。适应性NK细胞的天然存在提示NK细胞具备向适应性免疫转变的潜能，而iNK平台结合基因编辑策略（如CD38敲除）有望工程化生成具有记忆特性的下一代产品。此外，TriKE和CAR的整合可赋予NK细胞抗原特异性，并预防同种异体排斥。然而，对适应性NK细胞个体发育的分子机制仍需更深入的了解，以指导理性设计。
**研究结论**：过去十年NK细胞免疫疗法取得了显著突破，多个策略从实验室走向临床。未来成功的关键在于实现抗原驱动增殖、长期持久性和功能性记忆。基于此，ADAPT-NK细胞、CD38敲除的iNK细胞以及TriKE/CAR组合策略有望使NK细胞疗法达到甚至超过CAR T细胞的疗效，同时具有更好的安全性和更低的成本。