《International Journal of Molecular Sciences》：Immunodominant IgM Epitopes of the Angiostrongylus cantonensis Galectin-1 and Galectin-2 Proteins Recognized by Patients’ Sera: Optimization of an ELISA Assay for Human Acute Diagnosis of Angiostrongyliasis
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广州管圆线虫病(Angiostrongyliasis)是嗜酸性脑膜炎的主要病因，由广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)幼虫引起并经食入意外传播给人。其诊断依赖流行病学特征、临床症状、病史及实验室发现（尤以血和脑脊液嗜酸粒细胞增
广州管圆线虫病(Angiostrongyliasis)是嗜酸性脑膜炎的主要病因，由广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)幼虫引起并经食入意外传播给人。其诊断依赖流行病学特征、临床症状、病史及实验室发现（尤以血和脑脊液嗜酸粒细胞增多为特征），故准确诊断困难且易与其他寄生虫病混淆。本研究旨在绘制广州管圆线虫来源半乳凝素-1(Gal-1)与半乳凝素-2(Gal-2)蛋白上的IgM表位图谱，经数据库同源性分析评估表位特异性后，研究人员化学合成了12条四分支多重抗原肽(MAPs4)及一条65个氨基酸长的嵌合多肽，并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)评估合成肽效能。研究共发现12个独特IgM表位（Gal-1相关5个，Gal-2相关7个）。ELISA-肽法验证了上述表位，并以嵌合多肽作为包被抗原进行ELISA检测患者血清以体外诊断类圆线虫病（原文如此，指广州管圆线虫病）。本研究全面表征了A. cantonensis Gal-1与Gal-2的IgM表位，基于嵌合多肽的ELISA数据表明所选序列有望用于开发针对急性广州管圆线虫病感染的特异性免疫学检测方法。
论文解读：广州管圆线虫半乳凝素-1与半乳凝素-2蛋白免疫显性IgM表位鉴定及其在急性广州管圆线虫病ELISA诊断中的应用
本文发表于《International Journal of Molecular Sciences》。广州管圆线虫病（Angiostrongyliasis cantonensis）是由广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis）第三期幼虫感染人引起的食源性人畜共患病，临床可表现为嗜酸性脑膜炎、脑炎，严重者致残或致死。现行诊断多依赖临床推定、脑脊液嗜酸粒细胞增多及影像学，直接病原检出率低；传统粗抗原或重组蛋白血清学检测存在与并殖吸虫、颚口线虫等其他蠕虫交叉反应的问题，且IgG抗体在感染早期尚未产生，无法满足急性期早期诊断需求。半乳凝素（Galectin，一类含碳水化合物识别结构域CRD的β-半乳糖苷结合蛋白）在A. cantonensis中具强抗原性，是潜在的诊断靶标。为此，研究人员对A. cantonensis半乳凝素-1（Acan-Gal-1，285 aa，UniProtKB AEK98124.1）与半乳凝素-2（Acan-Gal-2，278 aa，UniProtKB AEK98123.1）进行IgM线性B细胞表位作图，筛选种属特异性表位并构建嵌合多肽，建立并验证基于IgM的肽ELISA（pELISA）方法用于急性期诊断。
主要关键技术方法：
研究人员收集巴西确诊广州管圆线虫病患者血清（n=19，具嗜酸性脑膜炎/神经症状及实验室嗜酸粒细胞增多证据）及健康献血员血清（n=40）组成样本队列。采用SPOT合成技术在纤维素膜上合成覆盖Acan-Gal-1与Acan-Gal-2全长的15肽重叠文库（偏移5 aa），以患者混合血清孵育后抗人IgM-碱性磷酸酶/化学发光检测进行表位作图；通过IEDB保守性分析、BLASTp比对筛查与其它蠕虫（含C. elegans、H. contortus但非人源寄生虫）的同源性以排除交叉反应表位；化学固相合成12条四分支多重抗原肽（MAP4）及含高特异性表位的65-mer嵌合多肽（Acan-CP-65，N端MGGS，C端六组氨酸标签RSHHHHHH，表位间以GPGPG连接）；以合成肽包被微孔板建立IgM-ELISA，通过ROC曲线确定cut-off值，评估分析灵敏度（LOD）、ED50、批内/批间变异系数（CV）及临床诊断效能（敏感性、特异性）。
研究结果：
2.1. Identification and Mapping of Linear Epitopes Using Synthetic Peptides
研究人员通过SPOT合成肽阵列与患者血清IgM孵育，在Acan-Gal-1上鉴定出4个IgM反应性线性表位区域（最终归纳5个表位），Acan-Gal-2上鉴定出8个（归纳7个表位），共计12个IgM表位。其中Gal-2肽B9（IFVDQKELKEYEHRL）和C15（LEPHELNGLQIGGDV）信号最强，表明Acan-Gal-2免疫原性强于Acan-Gal-1。表位二级结构预测显示多位于无规卷曲或环区。
2.2. Spatial Location of the Most Reactive Acan-Gal-1 and Acan-Gal-2 Epitopes
利用I-TASSER及AlphaFold获取Acan-Gal-1与Acan-Gal-2三维结构模型并将12个表位投射至表面，结果显示绝大多数表位位于蛋白表面的loop/coil区，亲水性分析也证实表位残基均处于亲水区段，表明这些区域溶剂可及性高、利于抗体结合。
2.3. Epitopes and Glycosylation
仅部分表位（Gal-1/01预测N-连接糖基化位点；Gal-1/03预测N-及O-连接；Gal-1/04含WGXEER基序；Gal-2/03）含潜在糖基化位点。两蛋白共享部分保守表位序列（如NEWGNEEREGK），突变表位（Gal-1/05与Gal-2/06）因含保守VGFDL区同样被IgM识别。NetMHCIIpan 4.1预测部分表位（如RFQVVIDQKEFRDYE、VPYESGIATGF）可与多个HLA II类等位基因（HLA-DRB1 * 07:01等）呈高亲和力结合，具广泛免疫识别潜力。
2.4. Selection of Putative Specific Epitopes
BLASTp比对PIR等数据库发现，仅Gal-2的两个表位（Gal-2/06、Gal-2/07）与数据库中其它蠕虫蛋白无≥4个连续氨基酸同源，具潜在种属特异性；其余表位与秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans或捻转血矛线虫Haemonchus contortus同源（二者不感染人）。合成的12条MAP4单肽ELISA验证均具反应性（RI≥0.75），以嵌合多肽Acan-CP-65（整合Gal-2/06、Gal-2/07及Gal-1/05）包被的检测反应性指数（RI mean=1.0±0.3）优于单肽，健康人血清无显著信号。该IgM-ELISA的分析灵敏度为0.01 mg·mL?1，ED50为0.052 mg·mL?1，批内CV 3.31%–11.12%，批间CV 3.99%–8.01%；ROC分析显示Acan-CP-65为基础的检测cut-off值为6×10?2，敏感性与特异性均达100%。
讨论与结论部分总结：
现有广州管圆线虫病诊断尤其急性期面临抗体未阳转、粗抗原交叉反应及侵入性操作限制。本研究首次系统绘制了Acan-Gal-1与Acan-Gal-2的IgM线性B细胞表位（共12个），结构建模与亲水性分析佐证其位于表面暴露的loop区，BLAST筛选获得具种属特异性的Gal-2/06与Gal-2/07表位。基于多重抗原肽及嵌合多肽的IgM-ELISA显示出优异的诊断灵敏度与特异性，克服了全虫抗原交叉反应局限。局限性包括样本量偏小及未涵盖所有地理株系差异，未来需在更广泛人群与不同病程阶段验证。研究人员得出结论：A. cantonensis半乳凝素-1与半乳凝素-2含有多个免疫显性、表面暴露的IgM表位，具良好诊断潜力；本研究推进了基于合成肽的广州管圆线虫病检测体系发展，支持在流行区开发准确、快速、可及的急性期诊断平台。
