《Brain Sciences》：Synaptic Inputs to OFF Parasol Ganglion Cells in Macaque Retina: An Analysis Using Serial Blockface Scanning Electron Microscopy
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背景/目的：神经节细胞是视网膜的投射神经元，存在多种类型，这些类型在形态、光反应以及中枢投射方面彼此不同。伞形细胞是灵长类视网膜的主要神经节细胞类型之一。其突触前双极细胞已得到较充分表征，但对提供其大部分输入的无长突细胞了解相对不足。本研究的目标是鉴定作为OF
背景/目的：神经节细胞是视网膜的投射神经元，存在多种类型，这些类型在形态、光反应以及中枢投射方面彼此不同。伞形细胞是灵长类视网膜的主要神经节细胞类型之一。其突触前双极细胞已得到较充分表征，但对提供其大部分输入的无长突细胞了解相对不足。本研究的目标是鉴定作为OFF亚型伞形细胞突触前成分的无长突细胞。方法：研究人员对来自1只成年猕猴的中央视网膜组织进行连续块面扫描电子显微镜（serial block-face scanning EM）处理，并分析位于中央凹中心颞侧2 mm处的内层视网膜图像体积。结果：研究人员重建了该体积内全部OFF伞形细胞，并分析了其中2个OFF伞形细胞的全部突触输入。这些细胞80%或更多的输入来自无长突细胞，其余输入来自双极细胞，且几乎全部来自OFF弥散型。许多突触前无长突细胞被充分重建，从而可归类为广域型或窄域型，其中以后者占优势。研究人员鉴定出5种特异性突触前无长突细胞类型，分别为AII、A4、结节样双分层1型（knotty bistratified type 1，KB1）、A13和Wiry 1型。值得注意的是，这些无长突细胞类型同样也是另一类主要神经节细胞——OFF侏儒神经节细胞——的突触前成分。结论：这些发现提示，侏儒神经节细胞与伞形神经节细胞之间光反应差异，更可能源于其突触前双极细胞类型的差异。
该文发表于《Brain Sciences》，聚焦于灵长类视网膜OFF伞形神经节细胞（OFF parasol ganglion cell）的突触前回路组成，核心问题是：尽管伞形细胞是猕猴视网膜中最重要的输出神经元类型之一，并与运动信息加工、瞬时性视觉反应以及青光眼易损性密切相关，但其接受的大量无长突细胞（amacrine cell）输入究竟来自哪些具体类型，既往仍缺乏清晰的超微结构证据。已有研究对其双极细胞（bipolar cell）输入认识较多，知道OFF伞形细胞主要接受OFF弥散型双极细胞输入；然而，既然无长突细胞构成其主要突触来源，那么阐明这部分抑制性或调制性网络的细胞学身份，对于理解伞形细胞为何具有瞬时反应特征、为何对眼压升高更敏感以及其与OFF侏儒神经节细胞在功能上为何明显不同，都具有重要意义。因此，研究人员开展本研究，试图利用高分辨率三维电镜重建方法，对OFF伞形细胞的全部突触前输入进行系统识别与归类。
在研究设计上，研究人员选取1只成年雄性猕猴（Macaca nemestrina）中央视网膜标本，取自中央凹颞侧2 mm区域，采用连续块面扫描电子显微镜（serial block-face scanning electron microscopy，SBF-SEM）获取内丛状层（inner plexiform layer，IPL）至神经节细胞层（ganglion cell layer，GCL）之间的连续超微结构图像，并通过数字重组、配准、三维标注和形态学重建，对视网膜局部体积中的神经元轮廓、突触连接和树突分层进行分析。研究结论表明，OFF伞形细胞的输入以无长突细胞为主，双极细胞仅占较小比例；在可鉴定的突触前无长突细胞中，窄域型占优势，且可明确识别出AII、A4、KB1、A13和Wiry 1型等具体类型。更重要的是，这些类型与OFF侏儒神经节细胞共享，提示两类主要OFF通路神经节细胞在无长突细胞层面的输入并无根本差异，二者光反应特性的显著不同更可能来自双极细胞输入谱的差异。这一认识推动了对灵长类视网膜并行信息通路组织原则的理解，也为解析青光眼相关易损神经节细胞的回路基础提供了结构学证据。
研究人员主要采用了连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）获取猕猴中央视网膜超微结构序列图像，样本来源为华盛顿国家灵长类研究中心提供的1只成年雄性猕猴中央视网膜。随后利用Nornir进行图像配准，借助Viking平台进行多用户在线标注，并依据突触小泡、突触带（synaptic ribbon）、轴突末梢形态、树突分层深度及树突侧向展布范围，对双极细胞和无长突细胞进行三维重建与分类；最终使用Matlab R2023a中的SBFSEM-tools完成IPL深度分析和三维渲染。
在结果部分，论文首先以“Ten OFF parasol cells were reconstructed”为核心内容，说明研究人员在该体积中共重建了10个OFF伞形细胞。它们胞体较大，位于GCL外排，主树突上行至IPL的S2层并形成致密丛。5个树突树完整的细胞平均树突野直径为85 ± 6.3 μm，细胞对之间平均树突重叠为55 ± 16.9 μm，重叠率约65%。这一结果确认了所分析细胞在形态学上符合既往对猕猴OFF伞形细胞的经典描述，也为后续输入分析提供了解剖学基础。
随后，在“ The neurons presynaptic to two neighboring OFF parasol cells were reconstructed”这一部分，研究人员对两个相邻OFF伞形细胞的全部突触前输入进行了系统重建。OFF伞形细胞223具有完整树突树，共接受508个突触，其中408个即80%来自无长突细胞；其余约101个突触主要来自OFF弥散型双极细胞，只有3%来自OFF侏儒双极细胞。另一细胞38706虽然树突树不完整，但因其接受较多KB1细胞输入而具有特殊分析价值；该细胞共接受341个突触，其中283个即83%来自无长突细胞，其余58个来自双极细胞，在已鉴定的50个双极细胞中仅5个即10%为侏儒双极细胞。该结果清晰表明，OFF伞形细胞的主要输入源并非双极细胞，而是数量上占压倒优势的无长突细胞，同时双极细胞输入以OFF弥散型为绝对主导。
在“Many of the amacrine cell processes presynaptic to the two OFF parasol cells were either dendrites or axons of wide-field amacrine cells”这一部分，研究人员依据树突侧向展布范围，将突触前无长突细胞区分为广域型（wide-field）和窄域型（narrow-field）。对于细胞223，在225个可分类的突触前无长突细胞中，88个即39%属于广域型；对于细胞38706，在142个可分类输入中，52个即37%为广域型。其余多数为窄域型。这一结果提示，尽管广域型无长突细胞确实提供了相当比例输入，但总体上窄域型无长突细胞在OFF伞形细胞突触前网络中占主导地位。
在“Some of the narrow-field amacrine cells presynaptic to the two OFF parasol cells resembled human A4 cells”部分，研究人员鉴定出部分窄域型输入细胞具有A4无长突细胞的典型形态特征，包括较小胞体、小型树突野以及回弯样树突，且这些树突在IPL中间三层形成较宽的树突丛。研究人员还指出，许多未能精确分类的无长突细胞突起也具有与A4相似的形态。这说明A4样细胞可能是OFF伞形细胞窄域型输入中的重要组成部分。
在“Other narrow-field amacrine cells presynaptic to the two OFF parasol cells were identified as the AII type”部分，研究人员依据S1层的分叶样树突附属结构、贯穿IPL的树突分支以及S5层来自杆双极细胞（rod bipolar cell）的突触输入，将另一部分窄域型无长突细胞鉴定为AII型。AII无长突细胞是经典的杆通路中间神经元，这一发现表明OFF伞形细胞不仅接受锥通路相关输入，也与杆通路相关网络存在结构联系，从而提示其对暗视觉或混合照明条件下的信号整合可能具有回路基础。
在“A third presynaptic narrow-field amacrine cell closely resembled the KB1 amacrine cells”部分，研究人员进一步鉴定出第三类窄域型输入细胞为结节样双分层1型（KB1）无长突细胞。该细胞树突在IPL中央两侧形成两个较宽且致密的树突丛，其形态与猕猴视网膜KB1细胞以及狒狒视网膜中表达囊泡型谷氨酸转运体3（vesicular glutamate transporter 3，vGluT3）的无长突细胞相似。研究人员此前已完整重建过其中1个KB1细胞及其突触联系，因此本研究中观察到其与OFF伞形细胞形成突触，进一步支持KB1/vGluT3样细胞是该通路的重要组成部分。
在“Presynaptic wide-field amacrine cells included an A13 amacrine cell”部分，研究人员将部分广域型输入鉴定为A13无长突细胞。其识别依据是具有串珠样（varicose）树突，并向IPL的S4层延伸。A13细胞作为广域型无长突细胞的代表，说明OFF伞形细胞接受来自较大空间范围的侧向调制输入。
在“Another type of presynaptic wide-field amacrine cell … was identified as Wiry type 1”部分，研究人员又识别出另一类广域型输入为Wiry 1型无长突细胞。这类细胞胞体相对较小，树突细而呈串珠样，主要行走于IPL最外侧两层，分支较少且多呈锐角，符合既往对猕猴Wiry 1型细胞的描述。该结果进一步说明，OFF伞形细胞所接受的广域抑制性或调制性输入并非单一来源，而是由多个形态学亚型共同构成。
在讨论部分，研究人员首先围绕不同无长突细胞类型可能的神经递质属性及功能意义展开总结。AII、A4以及文中讨论所涉窄域型细胞，多被认为可能通过甘氨酸（glycine）介导抑制作用；其中AII已知含甘氨酸，A4虽未直接鉴定递质，但依据哺乳动物窄域型无长突细胞的一般规律，推测也可能属于甘氨酸能类型。研究人员据此认为，这些细胞可能通过α1甘氨酸受体（alpha1 glycine receptor）抑制OFF伞形细胞感受野中心的光反应。与此同时，KB1细胞由于与vGluT3阳性细胞相似，且小鼠同类细胞对瞬时OFF α神经节细胞提供谷氨酸能兴奋性输入，因此研究人员认为KB1至OFF伞形细胞的突触很可能具有兴奋性。至于广域型无长突细胞，通常被认为以γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）为递质，且因其传导较慢、胞体分布距离不一，可能向OFF伞形细胞提供持续性抑制输入。Wiry 1型已知为GABA能；A13在猫视网膜中可对光刺激发生超极化并向OFF神经节细胞形成GABA能突触，因此也支持其抑制性作用。
论文讨论中最重要的综合性结论是：尽管OFF伞形细胞与OFF侏儒神经节细胞在光反应特性上差异很大，但二者却共享多种相同类型的突触前无长突细胞。这一结果出人意料，却具有重要解释力。研究人员据此提出，两类细胞功能差异更可能主要源于双极细胞输入的差别，而不是无长突细胞输入类型的本质差别。具体而言，OFF侏儒神经节细胞主要接受来自单一视锥的侏儒双极细胞输入，而OFF伞形细胞仅接受少量且变异较大的侏儒双极细胞输入，其主要兴奋性输入来自OFF弥散型双极细胞，尤其是DB2、DB3a和DB3b等在IPL更深处分层、预期具有更瞬时光反应特性的亚型。由此，OFF伞形细胞更适于形成瞬时、运动敏感的视觉输出，而OFF侏儒通路则更偏向持续性、高空间分辨率信息传递。
对于研究结论部分，可译为：这些发现提示，侏儒神经节细胞与伞形神经节细胞之间光反应的差异，很可能源于其突触前双极细胞类型的差异。
总体而言，本研究利用高分辨率三维超微结构重建，系统描绘了猕猴视网膜OFF伞形神经节细胞的突触前输入组成，明确证实其输入以无长突细胞为主，并从中识别出AII、A4、KB1、A13和Wiry 1型等具体来源。该研究的重要价值在于，一方面深化了对灵长类视网膜OFF通路精细回路结构的认识，另一方面通过与OFF侏儒神经节细胞的比较，为解释两类主要输出通路在时程特性和功能分工上的差异提供了直接结构证据。研究人员也审慎指出，样本仅来自1只雄性猕猴的单一区域，且只有少数突触前无长突细胞被明确分型，因此仍需更大范围样本与更全面重建加以补充；但在现有证据范围内，论文已经有力支持了“双极细胞输入谱差异是OFF伞形与OFF侏儒神经节细胞功能分化关键来源”这一核心观点。
