《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Visualization and Detection of Ciliary Beating Frequency in Human Airway Organoids based on image correlated methods for drug screening
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孙瑞萌|王道云|高超| Bing中兴|杜静|张立新|吴通|李子希|梁纳新|董文飞中国科学技术大学生命科学与医学部生物医学工程学院（苏州）摘要呼吸道纤毛的运动对于维持气道卫生至关重要，因为它能够定向摆动以清除病原体及杂质。纤毛功能异常会导致黏液堆积、感染以及呼吸系统疾病恶化。然而，
孙瑞萌|王道云|高超| Bing中兴|杜静|张立新|吴通|李子希|梁纳新|董文飞
中国科学技术大学生命科学与医学部生物医学工程学院（苏州）
摘要 呼吸道纤毛的运动对于维持气道卫生至关重要，因为它能够定向摆动以清除病原体及杂质。纤毛功能异常会导致黏液堆积、感染以及呼吸系统疾病恶化。然而，由于成像和分析方面的技术限制，研究纤毛动态仍然面临挑战。为解决这一问题，研究人员培养了能表达特定生物标志物的人类气道类器官，并使用电荷耦合器件相机捕捉纤毛运动情况。基于小波变换的图像处理方法可降低背景噪声、清晰呈现纤毛轮廓，从而实现彩色可视化与自动运动分析。此外，还开发了一种图像处理运动追踪系统，通过光学稳定、计算增强和模式识别技术来量化纤毛摆动频率。该方法能够提供时空可视化结果、分段的频率值、相关系数曲线以及实时更新的动态分析视频。自动纤毛识别技术提升了运动过程中的定位精度，减少了干扰。利用该平台，研究发现罗氟司特和普罗卡特罗能够有效增强纤毛摆动。转录组分析进一步揭示了调控纤毛结构和功能的关键网络。这一框架将机制研究与治疗筛选相结合，为推进呼吸系统研究及临床应用提供了有力工具。通过实现精准、高分辨率的纤毛运动分析，该方法解决了该领域的长期难题，为呼吸系统疾病的靶向治疗开辟了新途径。
引言 气道上皮细胞上的运动纤毛对于黏液纤毛清除机制而言至关重要，这一机制是呼吸系统清除黏液、病原体及吸入颗粒物的重要防御手段[1] 。纤毛的协调运动，包括快速的摆动阶段和较慢的恢复阶段，共同驱动着黏液纤毛清除过程[2] 。如果纤毛结构或运动功能出现障碍，就会影响黏液纤毛清除效率，使个体更容易遭受反复感染并出现气道损伤加重的情况。原发性纤毛运动障碍是一种遗传性纤毛疾病，而慢性阻塞性肺疾病和哮喘等获得性气道疾病也常常存在黏液纤毛功能下降的问题[3] 、[4] 。在原发性纤毛运动障碍中，纤毛功能障碍会引发持续性呼吸问题；而在慢性阻塞性肺疾病和哮喘中，纤毛缺陷则会加速疾病进展。
由于原发性纤毛运动障碍的临床表现具有多样性，且目前尚无单一的确诊方法，因此诊断该疾病颇具难度。尽管透射电子显微镜能够检测出轴丝结构异常，但许多经基因检测确认的病例在透射电子显微镜检查中却显示正常结果[5] 。为克服这一难题，目前的诊断方案会结合多种检测方法，包括用于检测纤毛摆动频率的高速视频显微镜分析、鼻部一氧化氮检测、纤毛蛋白的免疫荧光检测以及基因检测[6] 。不过，这些方法仍存在一些局限性，比如不同基因型患者的一氧化氮水平可能存在差异，而且现有的透射电子显微镜和高速视频显微镜等成像技术的灵敏度和分辨率也有待提升[7] 。尽管诊断工具不断进步，但纤毛动态的量化依然是一项挑战。目前可用于评估人类纤毛结构和功能的方法包括相位对比显微镜[8] 、微光度测量法以及光学相干断层扫描[9] 。虽然这些技术能够为了解纤毛运动提供有价值的信息，但它们也存在分辨率不足、背景干扰信号较多、视野较窄，以及由于纤毛反射率低而难以观察等问题[10] 。因此，有必要对这些方法进行进一步优化，以便更准确地捕捉不同条件下的纤毛运动变化。
为弥补现有研究的不足，我们研究了多种可用于研究纤毛功能障碍相关疾病的生物模型。细胞系因其操作简单且能生成大量样本而被广泛使用，但它们无法模拟天然组织的复杂微环境[11] 。相比之下，类器官模型虽能更好地保留肿瘤的组成和遗传特征，但其培养过程耗时较长且需要大量资源[12] 。近年来，源自人类的类器官逐渐成为更合适的模型，它们能更贴近地模拟天然组织的结构和功能[13] 。
在本研究中，我们开发了一种基于图像处理的新型方法，用于可视化并量化纤毛运动，从而实现对纤毛动态更可靠、无偏见的评估。该方法被应用于由人类组织衍生的类器官模型，有助于评估药物对纤毛功能的影响。此外，我们还通过RNA测序技术找到了调控纤毛结构和功能的关键网络。我们将成像技术与分子分析相结合的这种综合研究方法，有望为呼吸系统疾病的机制研究及治疗方法的开发带来突破，尤其是在纤毛疾病和气道疾病领域。
章节节选 人类气道类器官 呼吸道纤毛组织样本是在北京协和医院获得的，相关研究已获得该医院伦理委员会的批准，同时也取得了患者的知情同意。首先用无菌磷酸盐缓冲液（pH值为7.4，购自美国Gibco公司）对样本进行两次冲洗，之后在无菌条件下将临床样本切割成1-3立方毫米大小的碎片。这些组织碎片随后被放入含有II型胶原酶、dispase II、primocin和Y-27632的37摄氏度预温溶液中，在搅拌条件下酶解40分钟。
气道纤毛类器官模型的建立 为研究气道的纤毛摆动频率，我们按照已公布的方案成功建立了源自人类原始组织的气道类器官模型（见图1A）。从原始组织中分离出的单个细胞或小细胞团会随着时间逐渐生长成囊状或实性的类器官，大约15天后这些类器官的直径可达100微米左右（见图1B）。在具有腔结构的类器官中，从第20天起就可以观察到纤毛运动现象（见图1D）。
讨论 类器官技术已成为生物医学研究中的重要工具，主要应用于医学研究、药物研发以及再生医学领域[20] 。在制药领域，类器官技术可以为评估药物的疗效和毒性提供双重分析维度。此外，基于类器官的药物敏感性测试也为筛选具有再生功能的个性化治疗药物提供了可靠的平台[21] 。
对组织特有的生理活动进行定量分析具有重要意义
结论 总之，我们成功建立了一个人类气道组织类器官模型，该模型在组织病理学特征以及纤毛运动方面都与真实气道组织高度相似。我们还开发了一种基于图像处理的分析方法，用于检测纤毛摆动频率，从而可以准确测量人类气道类器官中单个多纤毛细胞的纤毛摆动频率。此外，我们发现不同类器官对化疗药物的反应存在差异，而这些差异与相应的基因表达水平密切相关。这一发现
CRediT作者贡献说明 董文飞： 资源提供、概念设计。 孙瑞萌： 写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、数据可视化、结果验证、研究监督、软件使用、资源协调、项目管理、研究方法设计、实验开展、资金获取、数据正式分析、数据整理、概念设计。 梁纳新： 概念设计。 吴通： 资源提供、研究方法设计、概念设计。 李子希： 概念设计。 张立新： 写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、概念设计。
伦理审批与参与者同意书 这项涉及人类参与者的研究已经获得了北京协和医院伦理委员会的批准（批准编号为I-22PJ585），并且所有参与者都签署了知情同意书
数据可用性 由于相关药物筛选数据仍属于正在进行的科研项目的一部分，因此可以在合理请求下从通讯作者处获取这些原始数据。作者声明，所有相关数据均存在于论文及其补充信息文件中，或者可以通过wenfeidong@sibet.ac.cn联系到通讯作者获取。（
wenfeidong@sibet.ac.cn ）
资金支持 本研究得到了中国国家重点研发计划 （项目编号：2023YFB3210300）、中国国家自然科学基金 （项目编号：82172077、22201298和62027825）的资助
利益冲突声明 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢 我们衷心感谢北京协和医院 提供的人类生物样本。同时，我们也感谢北京工业大学 以及中国科学院所属的苏州生物医学工程与技术研究院为我们的研究提供的实验基础设施和技术支持。
