《Microbiology Spectrum》：Development and preliminary clinical validation of A29L mAb-based ELISA and lateral flow immunoassays for monkeypox virus detection
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猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)构成重大且持续性的公共卫生威胁，凸显了开发可及、准确诊断工具的迫切需求。病毒包膜蛋白A29L是免疫显性和高度保守的免疫测定开发靶标。本研究旨在制备针对A29L的新型单克隆抗体(monoclonal anti
猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)构成重大且持续性的公共卫生威胁，凸显了开发可及、准确诊断工具的迫切需求。病毒包膜蛋白A29L是免疫显性和高度保守的免疫测定开发靶标。本研究旨在制备针对A29L的新型单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)面板，并开发高灵敏度实验室用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)与快速侧向流免疫层析试验(lateral flow immunoassay, LFIA)，用于特异性抗原检测。经免疫和杂交瘤筛选，选出6株抗A29L高亲和力mAb并全面鉴定。利用该抗体面板建立双抗体夹心ELISA，检出限(limit of detection, LOD)低至31.25 pg/mL，线性范围良好。使用疑似MPXV感染者样本（血浆、水疱液、拭子）进行临床评估，ELISA检测血浆样本灵敏度为95%、特异度为100%，性能与金标准聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)相当，优于市售试剂盒。此外，所开发的LFIA在血浆中灵敏度为58.3%(7/12)，在水疱液中为40.0%(4/10)，高病毒载量样本中可完全检出，证实其具备现场即时检测(point-of-care, POC)应用潜力。综上，研究人员提出一种实用分层诊断策略，整合高灵敏度确诊型ELISA与快速一线LFIA，弥补集中确证检测与分散现场监测间的关键缺口，显著提升MPXV暴发应对能力。
本文对发表于《Microbiology Spectrum》的论文《Development and preliminary clinical validation of A29L mAb-based ELISA and lateral flow immunoassays for monkeypox virus detection》进行解读总结。
【研究背景与意义】
猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV；正痘病毒属Orthopoxvirus，痘病毒科Poxviridae)自2022年多国暴发被世界卫生组织(WHO)宣布为国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)以来，已从地方性热带病转变为全球公共卫生威胁。MPXV感染早期表现为发热、淋巴结肿大及肌痛等非特异性症状，皮疹亦难与水痘-带状疱疹病毒(VZV)等鉴别。目前确诊依赖病毒DNA的实时荧光定量PCR(qPCR)，但该方法需精密仪器、专业技术人员及稳定供应链，在资源受限地区或暴发快速响应中存在明显瓶颈，延误结果反馈并妨碍及时公卫干预。尽管MPXV A29L包膜蛋白已被确认为保守且免疫显性的抗原检测靶标，但缺乏配套的高亲和力、高特异性单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)及基于其开发的成熟免疫测定平台。因此，研究人员通过开展靶向A29L新型mAb制备及双抗体夹心酶联免疫吸附试验(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, sandwich ELISA)与胶体金侧向流免疫层析试验(lateral flow immunoassay, LFIA)的开发与临床验证，填补这一诊断空白，为实验室确诊与现场筛查提供分层诊断工具包。
【主要关键技术方法】
研究人员以pGEX-4T-1载体表达并纯化MPXV A29L-GST融合蛋白作为免疫原，免疫SPF级BALB/c雌性小鼠后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞电融合制备杂交瘤，经间接ELISA筛选及有限稀释法亚克隆获得抗A29L mAb，进行亚型鉴定、可变区互补决定区(complementarity-determining region, CDR)测序及Western blot验证。通过斑块减少中和试验(plaque reduction neutralization test, PRNT)评估mAb中和活性。将纯化mAb生物素化后进行配对筛选确定最佳捕获/检测抗体组合，建立并优化sandwich ELISA，评估分析灵敏度(LOD、LOQ)、线性范围、精密度及交叉反应性。同时比较两种抗体排布配置开发胶体金LFIA。临床评估所用样本为武汉市金银潭医院收集的疑似MPXV感染者的血浆、水疱液及咽/肛拭子，以qPCR为参考标准评价两项 assay 的临床敏感度与特异度。
【研究结果】
重组抗原制备、免疫与杂交瘤生成
研究人员将原核表达的A29L-GST融合蛋白免疫小鼠，五只小鼠血清间接ELISA效价均显著升高，选取效价最高者脾细胞与SP2/0电融合，HAT筛选后获>200株初筛阳性克隆。
抗A29L mAb的筛选与生化鉴定
从中选出6株稳定分泌高活性抗体的杂交瘤克隆(MPXV-mAb#5、#25、#28、#87、#94、#111)，免疫球蛋白亚型分别为IgG1/κ(2株)、IgG2a/κ(1株)、IgG2b/κ(3株)；5株mAb重链(VH)与轻链(VL) CDR序列互异确认单克隆起源；还原与非还原SDS-PAGE显示正确二硫键组装(~150 kDa非还原；~50 kDa重链，~25 kDa轻链)。
抗A29L mAb中和活性
PRNT结果显示mAb#5、#28、#87、#94、#111在测试浓度下无中和活性(IC50>0.10 mg/mL)，mAb#25具中度中和活性(IC50=0.025 mg/mL，约173 nM)，提示其识别A29L参与病毒入侵的功能表位，但所有mAb均适用于诊断试剂开发。
优化sandwich ELISA的分析性能
六株mAb经生物素化配对筛选，确定mAb#94为包被捕获抗体、Bio-5为检测抗体组合信号噪声比最优。优化后ELISA线性定量范围为31.25–2000 pg/mL，LOD=31.25 pg/mL，LOQ=62.50 pg/mL；板内与板间变异系数(CV)分别<8%和<12%；与牛痘病毒(VACV)、VZV、单纯疱疹病毒(HSV)、人腺病毒(HAdV)、肠道病毒71型(EV71)、发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)均无交叉反应，特异性良好。
LFIA构型比较与选择
对比两种胶体金LFIA构型——(a)T线包被mAb#5、金标mAb#94与(b)T线包被mAb#94、金标mAb#5——构型b分析灵敏度更优，可见T线出现在A29L抗原浓度62.5 ng/mL，最低 faint带至12.5 ng/mL，选定构型b进行临床评价。
ELISA与LFIA临床评估
以qPCR为参照，sandwich ELISA检测血浆敏感度100%(10/10)、水疱液40%(4/10)、咽拭子0%(0/10)，特异度100%，优于市售A29L ELISA试剂盒(各样本类型检出率≤10%)。LFIA检测12份血浆中7份阳性(58.3%)、10份水疱液中4份阳性(40.0%)；qPCR Ct<30的高病毒载量样本中LFIA敏感度为100%。证实ELISA适合中心实验室确证，LFIA适合高病毒载量疑似病例现场初筛。
【讨论与结论】
研究人员指出，新制备的6株抗A29L mAb识别非重叠表位，使mAb#94/Bio-5夹心配对实现高灵敏度(LOD 31.25 pg/mL)，优于既往报道的MPXV免疫测定。LFIA虽灵敏度低于ELISA，但对高病毒载量(Ct<30)样本与qPCR一致性好，适合"检出即隔离"的现场分诊与传播链阻断。自建ELISA性能超越同期市售同类试剂盒，印证从头开发定制化高亲和力抗体对的优势。研究局限包括临床样本量较小(n=22 LFIA组，均为IIb分支)、单中心且未涵盖其他MPXV分支，A29L氨基酸在主流分支间同源性>99%支持跨分支适用性但仍需多中心大样本验证，LFIA现场长期稳定性及A29L潜在突变影响亦需随访。综上所述，研究人员成功制备抗MPXV A29L高亲和力mAb面板，开发了分析灵敏度达31.25 pg/mL的sandwich ELISA及快速胶体金LFIA，临床验证显示二者分别适用于实验室确诊与现场初筛，形成互补的分层诊断策略，为新兴病原体快速诊断试剂开发提供了可借鉴的模式与基础。
（注：原文中作者贡献均等作者为J.G. Liu, X.J. Hu, Q. Chen, X.L. Xiong；共同通讯/指导为F.L. Ren, J. Lu, L.G. Ruan）
