神经母细胞瘤是儿童中常见的实体肿瘤，在儿童癌症死亡中占有过高比例。高危神经母细胞瘤是一项重大临床挑战，尽管经过强化治疗，生存率仍低于50%。MYCN原癌基因扩增是高危疾病的标志性特征。MYCN蛋白是一种促进增殖并阻断分化的转录因子。由于缺乏酶活性且其内在无序特性意味着缺少明确的可供小分子结合的口袋，MYCN常被描述为"不可成药"。本综述探讨MYCN的分子相互作用组作为治疗发现的机会。研究人员重点阐述了与关键伙伴如MAX、WDR5、TFIIIC5和Aurora激酶A（AURKA）相互作用的功能和结构特征。研究人员讨论了破坏MYCN相互作用的新兴策略，以及通过破坏蛋白稳定机制或使用蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）等降解剂来促进其降解的方法。通过整合MYCN生物学、分子结构和化学生物学知识，这些方法为MYCN驱动型神经母细胞瘤的靶向治疗提供了有前景的途径。
神经母细胞瘤概述
神经母细胞瘤是起源于交感神经系统原始神经嵴细胞（NCCs）的胚胎性肿瘤，通常发生在肾上腺或交感神经节。该疾病具有高度异质性，肿瘤可自发退化或进展。作为婴幼儿最常见的颅外实体肿瘤，神经母细胞oma占儿童恶性肿瘤的6%–10%，却导致约15%的儿童癌症死亡。约90%的神经母细胞瘤确诊于5岁以下儿童，中位诊断年龄为17–22个月。国际神经母细胞瘤分期系统（INSS）根据分期、诊断年龄、肿瘤组织病理学、DNA指数和MYCN扩增状态将患者分为低危、中危和高危组。为进一步优化分类，国际神经母细胞瘤风险组分期系统被建立以更好地基于临床表现和肿瘤生物学对患者进行分类。
神经母细胞瘤症状与临床表现
神经母细胞瘤可发生于存在交感神经组织的任何部位，最常见原发部位为腹部，以肾上腺受累为主。60%–70%患者表现转移性疾病，通过淋巴管和血液播散至骨髓、骨、皮肤、肝脏和淋巴结等部位。转移导致相应症状如全血细胞减少、骨痛、皮下结节、腹部膨隆和淋巴结肿大等。极少数情况下（<5%），肿瘤转移至中枢神经系统和肺部。这种广泛的临床表现变异增加了准确诊断的难度。
低危与高危神经母细胞瘤的治疗差异
低危和中危患者无事件生存率约为80%–95%，而高危患者无事件生存率低于50%，且存在对治疗无应答的难治性高危亚群。低危和中危患者仅需手术、短期化疗或放疗等较温和治疗；高危患者则需经历手术、化疗、放疗、干细胞移植、免疫治疗和维甲酸治疗三阶段强化方案。尽管5年生存率从29%提升至50%，高危患者预后仍差，复发后极少治愈。MYCN扩增是驱动高危疾病进展的关键因素，也是最强的不良预后标志物之一，因此靶向抑制MYCN扩增可能改善高危神经母细胞瘤的治疗结局。
MYCN与MYC蛋白家族
MYC蛋白家族包括MYC、MYCL和MYCN三个旁系同源蛋白，在发育和组织稳态中具有生理功能。这些蛋白通过基因扩增、染色体易位、增强子失调、信号激活、蛋白稳定和罕见点突变等机制发生致癌转化。MYC蛋白的致癌功能主要通过放大现有转录程序实现，涉及激活或抑制增殖、代谢、分化、凋亡等过程的靶基因。MYC和MYCN结构与功能相似，高度同源，但时空表达模式不同：MYC具有更广泛的一般性作用，而MYCN和MYCL在特定组织和发育阶段发挥专门作用。小鼠研究表明，虽然MYC或MYCN纯合缺失不会导致失控增殖，但两者功能冗余不完全，MYCN替代MYC仅能部分挽救胚胎致死性。
MYCN在神经母细胞瘤中的作用
与MYC广泛参与多种癌症不同，MYCN作用更为局限和特异——主要驱动起源于中枢和周围神经系统的儿童恶性肿瘤，包括神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤。MYCN在发育特定细胞谱系中表达，在正常儿童和成人组织中表达极低，这为靶向治疗提供了有利治疗窗口。MYCN定位于2号染色体短臂远端（2p24），该区域的扩增在约25%的原发性神经母细胞瘤患者中观察到。MYCN扩增（通常定义为>10拷贝/细胞）源于基因组不稳定性，以染色体外环状DNA（ecDNA，又称双微染色体）或染色体上均匀染色区（HSR）形式存在。关键的是，增强子序列与MYCN基因共扩增，这些增强子被核心调控环路（CRC）转录因子识别，驱动MYCN基因表达并维持高水平。
MYCN在神经母细胞瘤发病中发挥多重作用：诱导恶性转化、维持NCCs干性特征、刺激增殖并阻止凋亡。作为转录因子，MYCN激活与增殖、转移、多能性、自我更新相关的基因，同时抑制拮抗癌变的基因，以维持干性、逃避细胞周期阻滞和免疫监视。另一关键功能是抑制交感神经神经元（神经嵴来源细胞）的终末分化。正常发育中，MYCN早期高表达驱动NCCs增殖和迁移，随后表达下调对分化至关重要。神经母细胞瘤中，MYCN扩增导致神经母细胞分化失调和迁移异常。正常不对称细胞分裂精确平衡自我更新与分化，而MYCN过表达促进对称细胞分裂，增加自我更新并扩增未分化细胞群体，这既促进肿瘤进展也参与肿瘤启动。
MYCN结构与相互作用组
人MYCN与MYC约有45%序列同一性，保守残基聚类于蛋白-蛋白相互作用关键位点。MYCN由464个氨基酸组成，分子量约50 kDa，含有六个MYC同源框（MBs）：MB0、MBI、MBII、MBIIIa、MBIIIb和MBIV。
N末端转录激活结构域（TAD）包含MB0、MBI和MBII。MB0对肿瘤启动非必需，但加速肿瘤生长，分子水平上促进与一般转录延伸因子TFIIF和TFIIIC的相互作用，也与AURKA激酶和蛋白磷酸酶1相关蛋白PNUTS相互作用。MBI中T58和S62残基是调控MYCN活性和稳定性的重要磷酸化位点。MBII通过组蛋白乙酰转移酶复合物（HATs）介导的染色质从抑制态向激活态转换，对转化和转录激活至关重要，支架蛋白TRRAP及其相关HAT复合物是MBII的关键互作伙伴，包括GCN5含有的STAGA复合物。值得注意的是，非转化性MB0缺失（ΔMB0）与MBII缺失（ΔMBII）共表达可挽救MYCN转化活性，这种反式互补性表明不同MB基序可半自主地与不同结合伙伴作用以实现共同目标——促进致癌性MYCN活性。
中央区域包含MBIIIa、MBIIIb、MBIV和核定位信号（NLS）。NLS与MBIV重叠，通过importin-α介导核输入，该相互作用已被X射线晶体学解析。MBIV与多功能转录辅调节因子HCF-1相互作用。MBIIIb基序结合COMPASS/MLL组蛋白甲基转移酶复合物组分WDR5，使MYCN能够结合染色质并维持活跃转录状态。晶体结构显示WDR5的β-螺旋桨结构域识别MYC的MBIIIb，位点与其MLL等其他互作蛋白不同。
C末端包含用于序列特异性DNA结合的基本区（BR）和介导与含bHLH-LZ结构域伙伴蛋白（如MAX）形成异源二聚体的螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（HLH-LZ）结构域。无DNA时，BR可形成螺旋结构，但构象灵活性更大。MYC可与锌指转录因子Miz1形成替代复合物抑制细胞周期抑制基因转录，但MYCN与Miz1相互作用弱得多，这一差异构成了MYC驱动与MYCN驱动癌症之间不同致癌程序的基础。
MYCN主要由内在无序区域（IDRs）组成，部分区域具有螺旋倾向性。结合伙伴或经翻译后修饰时，这些IDRs可发生从 disorder 到 order 的转变，或持续处于无序状态形成"模糊"复合物。MYCN可能以不同稳定构象或动态状态结合众多伙伴，这种结构动态性意味着直接靶向MYCN具有挑战性，因其缺乏稳定口袋供小分子抑制剂或PROTACs结合。
MYCN与MAX的相互作用
哺乳动物具有单一MAX基因，可变剪接产生不同蛋白变体，主要形式为p21和p22，在静止、生长和分化细胞中均高水平组成性表达。MAX与MYCN类似，含有bHLH-LZ区域，可形成同源二聚体或异源二聚体。体外研究表明，平衡态时MYCN/MAX异源二聚体占主导。MAX也可结合其他bHLH-LZ家族成员，但每种异源复合物具有不同的靶基因谱。
MYCN/MAX异源二聚体通过MYCN的基本区优先结合增强子框（E-box，5′-CACGTG-3′）基序，招募染色质修饰酶维持染色质非凝聚状态。该异源二聚体对MYCN功能至关重要，无MAX时蛋白无活性，无法调控增殖、生长、分化和凋亡等关键过程的靶基因。神经母细胞瘤中MAX表达具有变异性且与临床结局相关：MYCN低水平时MAX高表达与更好预后相关；但MYCN扩增型神经母细胞瘤中，MAX高表达导致更具侵袭性的肿瘤。MYCN扩增细胞中MAX沉默可减少细胞生长、运动性并促进分化。
AURKA与MYCN稳定性调控
AURKA属于有丝分裂丝氨酸/苏氨酸激酶家族，参与调控细胞周期G
2/M转换、有丝分裂纺锤体组装和遗传保真性等重要有丝分裂过程。正常情况下，Aurora激酶表达严格细胞周期调控，晚期有丝分裂时降解，G金碧辉煌仅在G
1期检测到残余水平。癌症中AURKA常通过基因扩增或降解受损而失调，导致整个细胞周期中蛋白水平升高，与增殖增加和靶向治疗及化疗抵抗相关。
正常细胞中MYCN为短寿命蛋白，半衰期约30分钟。MBI内的磷酸化调控其泛素化和蛋白水解以调节稳定性：ERK或CDK1/cyclin B首先磷酸化S62，随后GSK3β磷酸化T58。这些位点磷酸化作为SCF
FBXW7泛素连接酶识别位点，标记其进行蛋白酶体降解。神经母细胞瘤中，AURKA过表达与MYCN稳定性增强相关，因其拮抗FBXW7对降解信号的识别，使MYCN免于降解而积累。
AURKA通过广泛界面与MYCN相互作用，仅部分界面被晶体结构捕获。MYCN的AURKA相互作用螺旋（AIH）位于磷酸化退化子C末端，与AURKA的C-叶相互作用，从而与FBXW7竞争。该基序在MYC中不保守，但MYC中等效区域已被捕获与TFIID复合物核心组分TBP/TAF1的晶体结构。这些等效基序在不同伙伴结合时均形成螺旋结构，提示尽管序列不同但机制相似。核磁共振（NMR）研究阐明MYCN其他与AURKA相互作用区域包括MB0、MBI和MBII，MB0-MBI区域与激酶N-叶相互作用。MYC的NMR研究显示类似相互作用模式，且MBI磷酸化增强与AURKA的相互作用。
AURKA-MYCN相互作用细胞周期调控，S期达到峰值。MYCN也是AURKA催化活性的激活因子，S期活性AURKA招募至染色质有助于通过磷酸化组蛋白H3等底物防止转录-复制冲突。其他MYCN结合伙伴显示相反细胞周期依赖性：S期相互作用减弱。AURKA可直接从MYCN置换包括TFIIIC复合物在内的因子。
TFIIIC与MYCN染色质定位
TFIIIC是六亚基通用转录因子，结合Pol III转录基因（如tRNA基因）内部启动子元件（A-box、B-box）。结合启动子后，TFIIIC招募TFIIIB定位RNA聚合酶III于转录起始位点。TFIIIC也与粘连蛋白和CTCF相互作用，贡献于超越其Pol III特异性作用的高级染色质组织。TFIIIC调节MYCN在染色质上的定位，但不影响MYCN依赖性基因表达，而是精细调控MYCN的RNA相关功能：TFIIIC缺失增加MYCN对活跃启动子枢纽的占据，减少BRCA1和核外切体在这些位点的丰度——这是启动子近端RNA降解的关键因子。近期结构研究解析了MYCN的MB0与TFIIIC5的DNA结合结构域相互作用。尽管命名如此，该结构域对TFIIIC复合物的特异性DNA识别并非关键，而是提供了与MYCN的关键的男人重要界面，其调控因与非特异性DNA序列的竞争及TFIIIC5 C末端酸性plug序列的分子内相互作用而复杂化。TFIIIC因此成为MYCN染色质定位和RNA surveillance活性的调控者，在复杂的调控框架内可能提供治疗干预机会。
靶向MYCN治疗神经母细胞瘤的策略
与许多癌症不同，神经母细胞瘤突变较少，限制了精准医疗潜在靶点数量。MYCN生物学诸多方面尚不完全清楚，包括MYCN扩增的确切机制、MYCN与多样蛋白伙伴相互作用的调控和作用，以及哪些相互作用支撑MYCN驱动的肿瘤进展和不良临床结局。这些空白限制了特异性有效抑制MYCN疗法的开发。此外，由于MYCN的动态无序特性、复合物稀疏的结构数据以及传统小分子难以阻断蛋白-蛋白或蛋白-DNA相互作用，精准靶向MYCN证明具有挑战性。将MYCN视为蛋白复合物网络为治疗靶向提供了框架：破坏染色质结合、重编程转录活性或 destabilising 蛋白。
破坏MYCN染色质关联的策略
鉴于MYCN作为转录因子的功能，介导其染色质相互作用的蛋白伙伴代表了中断MYCN转录活性的潜在靶点。目前多数努力集中于开发MYCN/MAX异源二聚体抑制剂。已有小分子抑制剂如10074-G5、10058-F4和MYCi361报道可结合MYC/MYCN并稳定其内在无序单体，但开发强效、选择性、可溶且稳定的MYC/MYCN-MAX小分子化合物仍具挑战。另一方法是设计基于肽的迷你蛋白，尤以Omomyc的开创性工作著称。Omomyc源于MYC的bHLH-LZ区域，与MYC/MYCN及MAX形成无活性异源二聚体以阻止MYC/MAX二聚化。现已开发为细胞穿透版本OMO-103，在晚期成人实体瘤中安全完成I期临床试验。
另一有前景的方法是通过MYCN与WDR5的相互作用靶向MYCN。WDR5有两个可药靶位点：与MYC/MYCN相互作用的WBM位点，以及与MLL（组蛋白H3赖氨酸甲基转移酶的催化亚基）相互作用的WIN位点。已开发多种WIN位点抑制剂如OICR-9429。相比之下，WBM位点抑制剂发现耗时更长，部分由于该口袋更具挑战性。近期工作联合了WIN和WBM位点抑制剂，对神经母细胞瘤细胞活力产生协同效应，为通过药物组合优化WDR5靶向提供了明确机会。WDR5抑制剂确立了不靶向DNA结合域即可破坏MYCN染色质定位和功能的范式。这一概念未来将通过靶向MYCN其他关键相互作用伙伴得到更广泛探索。
靶向组蛋白修饰酶调控MYCN转录输出
MYCN蛋白与多种组蛋白修饰酶存在功能和物理相互作用，这些酶通过调控染色质可及性影响MYCN的转录输出。抑制这些MYCN伙伴可通过表观遗传修饰或染色质重塑间接抑制MYCN的致癌转录活性。这些酶具有含活性位点和其他口袋的折叠结构域，相比动态无序的MYCN蛋白是更直接的药物化学靶点，但可能因这些蛋白的其他功能而降低治疗窗口。
MYCN与组蛋白去甲基化酶存在明确功能联系。MYCN招募KDM4B至靶基因，使其去除抑制性H3K9me2/me3标记。此外，遗传敲除KDM4A、KDM4B或KDM4C中任一个均可减少MYCN扩增神经母细胞瘤细胞在体外的生长和异种移植模型中的成瘤。值得注意的是，泛KDM4抑制剂QC6352在两种MYCN扩增细胞系的异种移植中显示疗效，与化疗联合时产生持久应答。然而，非MYCN扩增异种移植模型也观察到类似应答，与KDM4去甲基化酶更广泛的转录调控程序一致。MYCN中央区域和KDM4B的PHD/Tudor结构域对其结合是必需的，但需进一步工作精细绘制相互作用位点并确定是否为直接相互作用。
类似地，LSD1（KDM1A）和HDAC1是CoREST辅抑制复合物组分，也是MYCN扩增癌症中的候选靶标组蛋白修饰酶。LSD1是组蛋白H3K4和H3K9去甲基化酶，在沉默神经分化相关基因中有关键作用。MYCN与LSD1可从神经母细胞瘤细胞中共免疫沉淀，该结合需要MYCN的MBIII。MYCN和LSD1共定位于CDKN1A基因（编码p21细胞周期抑制因子）启动子，LSD1抑制可缓解MYCN对其表达的抑制。多种LSD1抑制剂处于临床开发中，但神经母细胞瘤未受关注。LSD1抑制剂可在两种不同MYCN扩增细胞系中诱导细胞死亡，LSD1表达较高的IMR32细胞系更为敏感。MYCN扩增神经母细胞瘤中LSD1抑制剂需要更广泛、严格和机制性的测试。
大量证据表明组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在MYCN驱动的细胞周期控制、分化和凋亡基因转录调控中发挥重要作用。HDAC复合物与MYCN在靶基因启动子结合，可能通过多蛋白复合物介导，因无直接相互作用的明确证据。这些复合物调控决定细胞命运的细胞基因表达景观。HDAC抑制在神经母细胞瘤细胞模型中诱导细胞周期阻滞，如通过下调CDK4和上调p21阻止进入S期。鉴于HDAC的多效性功能，临床前和临床调查聚焦于理性联合策略以最大化治疗 impact 同时最小化毒性。例如，HDAC1/2抑制剂与13-顺式维甲酸（高危神经母细胞瘤维持治疗的标准组分）联合增强分化并降低神经母细胞瘤细胞系活力。但这些临床前观察尚未转化为稳健临床应答。进一步进展需要改进对单个HDAC在神经母细胞瘤生物学中特定作用的理解，以及更广泛地筛选理性联合治疗靶点。例如，高通量筛选已鉴定泛素特异性蛋白酶5（USP5）抑制剂与HDAC抑制在MYCN扩增神经母细胞瘤细胞系中具有协同作用，同时对正常人成纤维细胞毒性低。另一优先事项是阐明MYCN招募HDAC复合物至靶启动子的分子机制，并开发选择性破坏这些相互作用而不影响更广泛HDAC依赖性过程的抑制剂。
促进MYCN降解的策略
尽管MYCN生物学诸多方面尚待解决，去除神经母细胞瘤细胞中MYCN蛋白是一个有吸引力的概念。这可利用赋予MYCN稳定性的机制实现，如其与AURKA的相互作用。通过某些AURKA抑制剂间接靶向MYCN/AURKA相互作用可 destabilise 神经母细胞瘤细胞系中的MYCN，导致MYCN蛋白水平降低和神经母细胞瘤肿瘤生长抑制。这适用于某些AURKA抑制剂，因其稳定激酶的无活性构象，如MLN8054、MLN8237（alisertib）和CD532，这些与MYCN识别的活性激酶构象不兼容。然而，alisertib临床试验显示显著血液学毒性和总体应答率通常<15%，仍有改进空间。破坏MYCN相互作用的AURKA抑制剂开发仍在继续，近期例子包括DBPR728，对MYC高表达和MYCN高表达癌细胞系均显示活性。
MYCN刺激AURKA活性，后者磷酸化S期组蛋白H3S10，这一功能可通过AURKA和ATR联合抑制加以利用。但AURKA稳定MYCN降解的机制依赖于蛋白-蛋白相互作用，独立于其激酶活性。未来方向可能是开发阻断AURKA与MYCN相互作用的抑制剂，而不抑制激酶，以避免与抑制AURKA有丝分裂激酶依赖性功能相关的毒性。这具有挑战性，因为AURKA/MYCN界面有多个位点，晶体结构中唯一解析的位点与蛋白底物结合的关键口袋重叠。这一问题可能通过拟肽抑制剂解决，直接破坏该位点或通过变构机制作用的工具分子处于早期开发阶段。
MYCN驱动神经母细胞瘤的新兴策略是使用蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs），这类双功能小分子将蛋白靶标招募至泛素E3连接酶，实现多聚泛素化和降解。AURKA是有吸引力的PROTAC靶点，因其易于降解且有大量抑制剂可作为起点。基于alisertib的AURKA PROTAC已有报道，有趣的是它们不诱导alisertib或其他AURKA激酶抑制剂典型的严重有丝分裂阻滞。这种差异可能反映了中心体相关Aurora-A的部分保护，使细胞仅存在轻微缺陷即可通过有丝分裂。值得注意的是，基于alisertib的PROTAC未被报道引起MYCN降解。这可能因为alisertib稳定AURKA的无活性构象，减弱了MYCN的结合——MYCN偏好结合活性激酶构象。虽然基于AURKA选择性抑制剂设计PROTAC是合理的，但可能并非必要，因为相对非选择性的抑制剂支架可形成高度选择性的降解剂。确实，激酶可降解性全局图谱将AURKA列为第二易降解激酶，而AURKB未进入前二十。因此已探索多种化学骨架产生AURKA PROTAC：HLB-0532259基于CDK4/6抑制剂ribociclib；SK2188、SK4454和SK5527基于AURKA抑制剂MK-5108。这些PROTAC触发AURKA和MYCN的快速选择性降解，优先抑制MYCN扩增神经母细胞瘤细胞的增殖并诱导凋亡。这种选择性与Aurora-A PROTAC对MYCN相对于MYC的选择性一致，但尚未被正式证实。最优AURKA抑制剂用于PROTAC开发仍有待确定，但有充分理由支持使用结合AURKA活性构象并有利于与MYCN形成三元复合物的I型抑制剂。
其他MYCN相互作用伙伴正被探索作为PROTAC底物，如WDR5和BET家族蛋白。用人急性髓系白血病细胞系MV4-11处理的WDR5选择性PROTAC MS67可减少MYC的染色质结合，而MYC蛋白水平不受影响。虽WDR5 PROTAC尚未在神经母细胞瘤细胞中测试，预计至少可模拟WDR5-MYCN相互作用破坏剂的表型，若有改善。诱导BET家族蛋白降解的PROTAC ARV-825（BET家族蛋白对高MYC/MYCN表达是必需的）在MYCN驱动神经母细胞瘤细胞中显示活性。该PROTAC间接降低MYCN蛋白水平，通过减少其表达实现，对MYCN高水平的IMR-32细胞活力降低尤为显著，但MYCN以外的因素可能也贡献于该效应。目前无直接靶向MYCN本身的PROTAC，但相似概念分子胶已成功应用于MYC/MAX。化合物WBC100将E3连接酶CHIP胶联至MYC，触发其降解。类似理念可应用于MYCN，但如有适合胶或PROTAC设计的实验解析MYCN结构将加速该过程。在此之前，MYCN/MAX的计算模型可提供起点。
结论
MYCN在神经母细胞瘤发生和恶性进展中居于核心地位，突显其作为高危疾病治疗靶点的价值。但进展受限于对其相互作用网络的不完全理解，尤其是MYCN复合物高分辨率结构的匮乏。结构上已表征的蛋白相互作用组仅部分与当前探索的潜在药物靶点重叠。因此，MYCN扩增神经母细胞瘤治疗的未来进展可能聚焦于其蛋白复合物网络，通过破坏选定蛋白-蛋白相互作用与靶向降解MYCN相互作用网络关键组分相结合，利用情境特异性脆弱性。
